【摘 要】
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该研究采用基因工程手段,进行了人α-synuclen(h α-synuclein)基因cDNA的克隆,构建了野生型和突变型hα-synuclein的真核表达质粒pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut),将hα-syn
【出 处】
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上海第二医科大学 上海交通大学医学院 上海交通大学
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该研究采用基因工程手段,进行了人α-synuclen(h α-synuclein)基因cDNA的克隆,构建了野生型和突变型hα-synuclein的真核表达质粒pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut),将hα-synuclein基因转染PC12细胞使其过表达,并在此基础上观察hα-synuclein过度表达引起细胞的形态学变化,比较野生型和突变型hα-synuclein过表达对PC12细胞的毒性作用及其对蛋白酶体抑制剂的毒性易感性,初步探讨了α-synuclein基因在PD发病机制中的作用,为进一步的研究奠定基础.该课题分三个部分第一部分:野生型和突变型α-synuclein真核表达载体构建采用RT-PCR从人胚脑组织中扩增人α-synuclein基因,构建至真核表达载体pEGFP-N1中,再采用重叠延伸法(SOE法)定点突变,构建了突变型α-synuclein基因真核表达载体.结果表明所得到的片段与报道序列的同源性达100﹪(突变型达99﹪),并且成功地将片段克隆到了真核表达载体上.第二部分:野生型和突变型hα-synuclein在PC12细胞中的表达将已构建的pEGFP-N1/hα-synuclein(wt/mut)重组质粒转染PC12细胞,Western-blot法证实细胞内有hα-synuclein(wt/mut)融合蛋白表达.野生型和突变型hα- synuclein瞬时表达对PC12细胞形态无明显影响,它们广泛分布于细胞核与细胞质中,与内源性α-synuclein的分布相一致;采用MTT比色法证实A30P突变型hα-synuclein对PC12细胞有毒性作用;用磷脂酰丝氨酸外翻分析(AnexinV)法检测发现突变型α-synuclein基因瞬时表达能够诱导PC12细胞发生凋亡.第三部分Lactacystin对过表达α- synucleinPC12细胞的毒性作用采用MTT法检测蛋白酶体抑制剂Lactacysth对PC12细胞活性的影响,加入Lactacystin24小时后,PC12细胞活性明显下降,呈剂量依赖性,过表达hα-synuc1ein(wt/mut)-EGFP的PC12细胞对蛋白酶体抑制剂的毒性易感性增加,免疫荧光法发现蛋白酶体抑制剂可引起野生型和A53T突变型hα-synuclein的聚集增加,但A30P突变型则未见明显聚集.
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