天然免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,但是,过度活化的天然免疫反应会导致组织器官的损伤,可导致自身免疫病的产生甚至造成病人死亡,所以,天然免疫应答反应需要及时活化以有效清除入侵的病原体,同时,其应答程度与持续时间也应控制在适度范围内以维持机体平衡,可见,天然免疫应答反应的负向调控对于机体维持免疫自稳至关重要。近年来,发现与研究能够负向调控天然免疫的细胞和分子逐步成为天然免疫研究领域的前沿热点。本课题围绕着两个负向调控分子的作用与相关机制,分两部分开展了负向调控天然免疫应答及其机制研究,包括"LAPF抑制TLR触发巨噬细胞产生TNF-α及其机制研究”和"CD11b-Src信号通路促进M2型巨噬细胞产生及其机制研究”,以期通过我们的研究,加深对天然免疫调节和免疫自稳的认识和理解。第一部分LAPF抑制TLR触发巨噬细胞产生TNF-a及其机制研究包含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白LAPF(又叫PLEKHF1)是我们实验室从人树突状细胞cDNA文库中通过随机大规模测序发现的一个新的溶酶体相关蛋白并于2005年报道其参与TNF-a诱导的肿瘤细胞凋亡。然而有关LAPF在天然免疫中的功能还没有研究。在本课题中,我们制备了LAPF条件缺失的小鼠( lapfloxp/loxplyz2Cre/+),发现LAPF条件缺失小鼠相比于杂合子对照小鼠在内毒素休克模型中炎性细胞因子分泌增加,其中TNF-α显著升高,同时肺脏和脾脏中TNF-α的mRNA水平也显著升高,提示LAPF可能负向调控天然免疫反应与炎症发生。通过体外细胞实验,发现LAPF缺失的巨噬细胞在TLR配体刺激下分泌TNF-α升高并且TAK-、 IKKa/β和p65的磷酸化活化水平显著提高,表明LAPF能够抑制NF-κB信号通路的活化。利用Ip-质谱分析结合体外IP验证,我们发现LAPF可以与TLR信号关键转运蛋白TIRAP和MyD88结合,为进一步研究LAPF如何调控NF-κB信号通路、影响炎性细胞因子释放奠定了基础。第二部分CDllb-Src信号通路促进M2型巨噬细胞产生及其机制研究整合素信号对于天然免疫应答的调控一直是天然免疫的前沿热点问题。整合素对于天然免疫细胞的分化、发育、迁移、粘附和活化均有十分重要的作用。CDllb是整合素Mac-1的a链,CDllb的抗体常常用来筛选出巨噬细胞或者其它髓系来源的单核吞噬细胞。巨噬细胞根据表型和行使功能的不同又可以分为M1型(经典性活化的)巨噬细胞和M2型(替代性活化的)巨噬细胞,分别释放出促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子,M1和M2型巨噬细胞的平衡对于天然免疫的调节和自稳至关重要。我们实验室以往发现CDllb能够通过Src-Syk泛素化降解MyD88和TRIF,从而抑制天然免疫过程中TNF-a的产生。但是,CD11b-Src在巨噬细胞M1和M2的表型和功能中的作用并不清楚,值得进一步研究。我们发现在体外诱导肠炎模型中,CD1lb缺陷的小鼠以及利用Src抑制剂Dasatinib腹腔注射处理的小鼠,结肠部位的炎症反应均更为严重,小鼠TNF-a产量增加但IL-10的产量减少,同时,iNOS的表达增强但Arg-1的表达减弱。TNF-a和iNOS是M1型巨噬细胞的标志性分子,IL-10和Arg1是M2型巨噬细胞的标志性分子,这个现象提示了CD11b-Src信号可能促使巨噬细胞趋向于M2型巨噬细胞。为此,我们直接检测了用Dasatinib处理并且诱导肠炎的小鼠结肠部位的巨噬细胞类型,发现M1型巨噬细胞比例增加、M2型巨噬细胞比例减少。随后我们开展了CD11b-Src使巨噬细胞更趋向于M2型巨噬细胞相关机制研究,发现1)骨髓来源的巨噬细胞中CD11b-Src可以抑制IFN-γ诱导的M1型巨噬细胞标志分子iNOS的表达,CD11b-Src还能够促进IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志分子Arg-1和YM-1的表达；2)CDllb通过促进Src-Akt信号通路活化,促进了TLR诱导的STAT6活化和IL-10释放。进一步的机制研究发现,Src能够增强IL-4信号通路的Akt和STAT6活化,这两者均被报道能够促进M2型巨噬细胞表型分子的表达。但是,只有过表达STAT6能够逆转Src抑制剂对Argl的下调作用,提示STAT6在此过程的重要作用。Src能够和STAT6相互作用,形成复合体,也进一步提示Src能够参与活化STAT6.在TLR信号刺激下,Src则通过促进P13K的调节亚基p85的泛素化降解,促进PI3K-Akt信号通路活化,进而通过负向调控GSK促进AP-1的活化入核,最终促进IL-10的产生。综上,CD11b-Src通过促进STAT6和Akt活化而使巨噬细胞更趋向于M2型巨噬细胞。可见,CD11b-Src具有重要的天然免疫负向调控与控制炎症的作用,深入研究CD11b-Src的机制将有助于深入认识炎症的发生发展过程和抗炎药物的研发。