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肿瘤的复发和转移是一直困扰着临床医生的重要课题,限制着临床疗效的提高,在这一过程中,与机体免疫调节相关的细胞和因子发挥着重要作用,其中重要的细胞即为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM),在与肿瘤细胞相互作用方面,既往研究多表明,巨噬细胞是抗肿瘤免疫调控过程中的一组重要细胞群,其可以直接杀伤肿瘤细胞,或者通过递呈肿瘤相关抗原诱导机体产生免疫应答从而清除肿瘤,发挥相应的抗肿瘤效应。但随着近年来对肿瘤及肿瘤间质的研究不断深入,人们发现TAM并没有发挥抗肿瘤作用,而是参与并促进了肿瘤发生、侵袭和转移的过程,其在促进肿瘤血管和淋巴管生成等方面具有十分重要的效应。目前认为,巨噬细胞至少包括2种不同活化表型和功能特征的亚群：①经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophages, caMphi) M1型；②替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophages, aaMphi) M2型。其中M1型巨噬细胞可通过直接或间接分泌多种促炎细胞因子杀伤病原体和肿瘤细胞；而M2型巨噬细胞表现为较低的抗原提呈能力,并可通过分泌抑制性细胞因子如IL-10、 TGF-β等下调免疫应答,促进肿瘤细胞的生长和远处转移。M1型和M2型巨噬细胞是巨噬细胞连续活化状态的两个极端,根据对甲状腺乳头状癌、卵巢癌和乳腺癌的研究结果,指出TAM可能发生替代性活化,TAM更偏向于M2型极化的巨噬细胞。中医药防治肿瘤复发转移作用明显,扶正解毒法是防治肿瘤术后复发转移的重要治疗法则,我科自行研制的扶正解毒口服液在临床应用上显示其能有效的防治肿瘤的复发和转移,我们课题的前期研究亦显示：扶正解毒方联合化疗能有效抑制小鼠前胃癌生长,减轻荷瘤小鼠怖转移程度,延长生存期,改善荷瘤小鼠预后,其作用机制在于减轻肿瘤组织中CD68+巨噬细胞浸润程度,减少M2型巨噬细胞的含量；降低血清中M2型巨噬细胞诱导因子及所分泌的免疫抑制因子IL-4,IL-10,IL-13,TGF-β的含量；降低免疫抑制细胞(CDllb+F4/80+巨噬细胞.MDSC)在脾脏中的含量,重塑机体免疫功能。基于前期的研究基础,我们进行了体外实验研究,以体外活化的肿瘤相关巨噬细胞为靶点,在与肿瘤细胞MFC细胞共培养的基础上,建立常氧和乏氧条件下的共培养模型,观察扶正解毒方对共培养体系下TAM细胞表面标记的影响,观察扶正解毒方对共培养体系中IL-10等免疫抑制因子的调控作用以及对共培养体系下TAM相关趋化基因mRNA的干预调控作用,以进一步揭示扶正解毒方调控肿瘤相关巨噬细胞介导的肿瘤微环境的分子机制。目的：1.阐述肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中的作用；2.揭示扶正解毒方调控肿瘤相关巨噬细胞介导的肿瘤微环境的分子机制。方法：1.制备大鼠空白血清和扶正解毒中药含药血清,作为本研究的实验用药；2.采用LPS和IL-4对RAW264.7细胞进行体外诱导活化,分别诱导其为M1型和M2型巨噬细胞,并进行活化表型的鉴定；3.建立体外活化的M2型巨噬细胞与小鼠前胃癌细胞(MFC细胞)的非接触式共培养体系；4.运用流式细胞技术,分别在常氧和乏氧条件下检测扶正解毒方在12h、24h、36h、48h对肿瘤相关巨噬细胞表型的影响；5.运用ELISA技术,分别在常氧和乏氧条件下检测扶正解毒方在12h、24h、36h、48h对共培养体系中IL-10、 IL-13和TGFβ表达的影响;6.运用荧光免疫PCR技术,分别在常氧和乏氧条件下检测扶正解毒方干预36h时巨噬细胞CCL22. CCL3、Arg I、iNOS和HIF1-α基因mRNA表达量的情况。结果：1.RAW264.7细胞经IL-4诱导24h后,M2型巨噬细胞标记CD206表达较未诱导组明显升高(p<0.05),经LPS诱导24h后,M1型巨噬细胞标记CD16/32表达较IL-4诱导组和对照组均明显升高(p<0.05)；诱导后各组M2型巨噬细胞表达量：aaMphi (IL-4诱导)> caMphi (LPS诱导)>RAW264.7(p<0.05);诱导后各组后M1型巨噬细胞标记表达量：caMphi (LPS诱导)>aaMphi (IL-4诱导)>RAW264.7(p<0.05)。2.在常氧和乏氧条件下建立起M2型巨噬细胞和MFC细胞的共培养模型。3.常氧条件下,共培养组别M2型巨噬细胞含量较非共培养组明显升高(p<0.05)；在36h时,扶正解毒中药血清组的M2型巨噬细胞表达量较空白血清组低,但差异无统计学意义(p>0.05)；共培养组M1型巨噬细胞含量均较非共培养组明显升高(p<0.05)；扶正解毒含药血清组M1型巨噬细胞表达量均较空白血清组明显升高(p<0.05)。乏氧条件下,共培养组别M2型巨噬细胞含量较非共培养组明显升高(p<0.05)；在36h和48h,扶正解毒中药血清组的M2型巨噬细胞表达量低于空白血清组,且在48h时差异具有显著意义(p<0.05)；共培养组别M1型巨噬细胞含量均较非共培养组明显升高(p<0.05)；扶正解毒含药血清组在12h、24h、36h其M1型巨噬细胞表达量均较空白血清组明显升高(p<0.05)。4.在常氧的各时间点,扶正解毒中药血清组的IL-10表达量均较空白血清组低,且在24h、36h、48h时差异显著(p<0.05),扶正解毒中药血清组IL-13的表达较空白血清组低,且在12h和24h时差异显著(p<0.05),在常氧和乏氧条件下,扶正解毒中药血清组TGF-β的表达均较空白血清组显著降低(p<0.05)。5.常氧条件下,共培养组CCL22基因表达较非共培养组上调,扶正解毒中药干预后CCL22基因表达明显下调(p<0.05)；常氧和乏氧条件下,共培养组CCL3、iNOS基因表达较非共培养组明显下调(p<0.05),扶正解毒中药干预后CCL3、iNOS基因表达则明显上调(p<0.05)；乏氧条件下,共培养组Arg I基因表达较非共培养组明显上调(p<0.05),扶正解毒中药干预后Arg I基因表达明显下调(p<0.05)。6.在常氧条件下,扶正解毒中药组与空白血清组HIFl-α的表达无统计学意义(p>0.05),在乏氧条件下,扶正解毒中药组HIFl-α的表达低于空白血清组,但差异无统计学意义(p>0.05)。结论：1.通过体外诱导可成功建立起M2型和M1型巨噬细胞模型,并可与MFC小鼠前胃癌细胞建立共培养体系；2.扶正解毒方在常氧和乏氧条件下均可一定程度降低共培养体系中M2型巨噬细胞比例,提高共培养体系中M1型巨噬细胞比例,促进TAM从M2型向M1型方向极化；3.扶正解毒方在常氧和乏氧条件下均可降低共培养体系中免疫抑制因子IL-10、 IL-13和TGF β的表达量,调节肿瘤细胞局部免疫微环境；4.扶正解毒方在常氧和乏氧条件下可下调共培养体系中M2型巨噬细胞特异性基因Arg I、M2型巨噬细胞趋化基因CCL22的表达,上调M1型巨噬细胞特异性基因iNOS. Ml型巨噬细胞趋化基因CCL3的表达,从肿瘤微环境中趋化基因和TAM特性性基因表达层面促使TAM从M2型向M1型方向极化；5.扶正解毒方可降低乏氧条件下共培养体系中HIF1-α基因的表达,一定程度改善肿瘤微环境中局部的缺氧状态。