研究背景:牙齿缺失是每一个人的一生中都无可避免的需要面临的问题,目前,对于牙齿缺失的解决方法,通常为:活动义齿、固定桥修复及种植牙。但是,活动义齿的功能性不足、固定桥修复中需要制备基牙、种植牙需要患者接受种植手术,所以,以上所述的方法均不是最为理想的缺失牙修复方式,因此,组织工程化牙齿就成为了大多数口腔科研工作者共同研究的目标。牙齿发育是一个复杂的过程,期间牵涉了众多的分子和信号通路,既包括牙釉质、牙本质、牙骨质和牙髓等不同组织之间的协调发育,又包括切牙、尖牙、前磨牙和磨牙不同部位的发育。因此,明确牙齿发育过程中的分子生物学机制,成为解决组织工程化牙齿的一大难题。颅神经嵴源性外胚间充质干细胞可以用作研究牙齿发育过程中分子生物学机制的载体细胞。外胚间充质干细胞被认为是除牙釉质以外所有牙齿资质的源细胞。这些细胞在胚胎发育期间,从颅神经嵴迁移到上颌和下颌的颌突位置,与牙源性上皮相互作用形成牙囊和牙乳头,其进一步分化成各种牙齿组织并形成牙骨质、牙周膜、牙槽骨、牙本质和牙髓。在牙胚发育的蕾状期,诱导牙齿形成的信号从上皮传递到间充质,牙源性上皮可以诱导间充质干细胞形成牙齿,这就是经典的上皮-间充质相互作用理论。颅神经嵴源性外胚间充质干细胞在这个过程中发挥了重要的作用。然而,牙齿发育过程中的确切分子机制仍不清楚,因此,研究牙齿发育过程中的分子生物学机制,对于组织工程化牙齿的研究进展尤为重要。P75神经营养因子受体(P75NTR)属于肿瘤坏死因子超家族的低亲和力神经营养因子受体。P75NTR是第一个被分离的神经营养受体,并在早期发育期间在神经细胞中高度表达,参与胚胎发生过程中神经嵴干细胞的增殖、迁移、分化、存活和凋亡。P75NTR在不同的细胞系中表现出不同的生物效应,在我们前期的研究发现,经P75NTR纯化后的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞,具有成神经、成肌、成软骨和成骨等多向分化能力。探寻P75NTR是否参与牙齿发育过程,以及其怎样调控牙齿发育的过程,并在此基础上研究其具体的分子生物学机制,是本课题重点解决的科学问题。方法:第一部分:我们首先针对牙胚发育的两个关键时间点12.5天和19.5天,通过腹部外科手术,在同一只SD孕鼠体内获取胚胎发育12.5天和19.5天的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞(ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs)。对两种不同时间点的细胞采用流式细胞技术进行干细胞表面分子标志物及P75NTR的检测。干细胞具有较强的多向分化潜能,为了进一步比较两个不同时间点细胞的分化能力差异,对两种细胞进行了成骨定向诱导分化实验,同时采用Real Time PCR以及western blot对成骨的关键基因ALP、RunX2进行了检测。通过碱性磷酸酶染色,更加直观的对比ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs的成骨分化差异。第二部分:明确P75NTR在牙胚发育过程中的作用。为了证明P75NTR参与牙胚发育,并明确其在牙胚发育过程中起着怎样的作用,我们进一步使用RNA干扰技术沉默P75NTR以及慢病毒转染技术过表达P75NTR,采用细胞免疫荧光染色鉴定沉默及过表达效率,Real Time PCR以及western blot检测ED19.5EMSCs中P75NTR的表达情况。分别将沉默及过表达后的细胞进行成骨定向诱导,在诱导的0天、14天、21天,采用Real Time PCR及western blot检测其P75NTR及成骨关键基因ALP、Run X2的表达情况。碱性磷酸酶染色及茜素红染色比较在成骨诱导不同时间点,ED19.5EMSCs的分化情况。第三部分:为了明确P75NTR参与牙胚发育过程中的分子生物学机制。我们采用P75NTR+ED12.5EMSCs以及P75NTR+ED19.5EMSCs制备Affymetrix表达谱芯片。通过对芯片结果的GO以及Pathway分析,发现Wnt信号通路在其中起着重要作用。采用Real Time PCR以及western blot在ED19.5EMSCs中检测Wnt信号通路的相关基因sost、Lrp6、β-catenin、LEF1以及CCND1。来进一步说明P75NTR在ED19.5EMSCs中是通过Wnt信号通路来参与成骨分化过程的。第四部分:牙齿发育这个复杂的过程,有着众多的分子以及信号通路参与其中,为了验证P75NTR确实参与了ED19.5EMSCs的成骨分化过程,而不是分化过程中的一个伴随现象。我们使用慢病毒转染过表达P75NTR并同时使用质粒转染过表达sost,采用Real Time PCR以及western blot检测了Lrp6、β-catenin、LEF1以及CCND1。并通过茜素红染色,更加直观的观察不同方法处理后的ED19.5EMSCs矿化结节的形成情况。结果:第一部分:ED12.5EMSCs和ED19.5EMSCs生物学行为的比较研究1.通过干细胞分子表面标记物检测发现表达相似的细胞表型,CD45-但是CD29+、CD44+、CD90+、CD105+、CD146+。2.ED19.5EMSCs中P75NTR的表达要显著高于ED12.5EMSCs。3.Real-time PCR及westernblot结果显示:ED19.5EMSCs在成骨诱导14天后成骨关键基因ALP、RunX2的表达水平显著高于ED12.5EMSCs。4.碱性磷酸酶染色结果显示:ED19.5EMSCs的矿化结节数量在成骨诱导14天后要多于ED12.5EMSCs。第二部分:明确P75NTR对ED19.5EMSCs骨向分化能力的影响1.沉默P75NTR后ED19.5EMSCs中的P75NTR表达水平下降;过表达P75NTR后ED19.5EMSCs中的P75NTR表达水平上升。2.细胞免疫荧光染色结果显示:沉默以及过表达均取得了较好的效率。3.Real-time PCR以及western blot结果显示:沉默P75NTR后,成骨关键基因ALP、Run X2表达下降;而过表达P75NTR后,ALP、RunX2的表达上升。在成骨诱导14天后,实验组和对照组之间就具有明显差异。4.碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示:成骨诱导14天后,碱性磷酸酶染色实验组和对照组之间矿化结节数量具有显著差异;成骨诱导21天后,茜素红染色实验组和对照组之间矿化结节数量具有显著差异。第三部分:P75NTR在ED19.5EMSCs中对Wnt经典通路的作用研究1.Affymetrix表达谱芯片结果显示:Wnt经典通路在ED19.5EMSCs中具有重要作用。2.Real-time PCR结果显示:沉默P75NTR后,Wnt通路关键基因sost、Lrp6、β-catenin、CCND1的表达水平下降;过表达P75NTR后,sost、Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平上升。3.Western blot结果显示:沉默P75NTR后,P75NTR、β-catenin、Lrp6表达下降,sost表达上升;过表达P75NTR后,P75NTR、β-catenin、Lrp6表达上升,sost表达下降。第四部分:P75NTR通过Wnt信号通路影响ED19.5EMSCs的成骨分化能力的分子机制研究1.Real-time PCR结果显示:过表达P75NTR后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平最高;过表达sost后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平最低;而同时过表达P75NTR和sost后,Lrp6、β-catenin、LEF1、CCND1的表达水平要高于过表达sost组,但低于过表达P75NTR组。2.Western blot结果显示:过表达P75NTR后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平最高;过表达sost后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平最低,sost表达水平最高;而同时过表达P75NTR和sost后,P75NTR、Lrp6、β-catenin的表达水平要高于过表达sost组,但低于过表达P75NTR组。3.茜素红染色结果显示:过表达sost组矿化结节数量最少,过表达P75NTR组矿化结果数量最多;同时过表达P75NTR和sost后,矿化结节数量要低于过表达P75NTR组,但要高于过表达sost组,同时其高于空白对照组,说明,在ED19.5EMSCs的成骨分化过程中sost的抑制作用要低于P75NTR的促进作用。结论:1.本研究成功在同一SD孕鼠体内获取了不同胚胎发育时间点的颅神经嵴源性外胚间充质干细胞,通过对比发现,ED19.5EMSCs具有更强的成骨分化潜能。2.本研究发现了P75NTR在ED19.5EMSCs中对于成骨分化能力具有促进作用。3.Wnt通路在ED19.5EMSCs中具有重要作用,P75NTR可以正向调控Wnt信号通路的活性。4.P75NTR通过抑制sost的活性,激活Wnt通路,进而在ED19.5EMSCs中促进其成骨分化能力。综上所述,我们的研究结果表明Wnt通路在ED19.5EMSCs中发挥主导作用,P75NTR可以负向调节sost,激活Wnt信号通路活性,进而促进成骨分化。本研究不仅加深认识颅神经嵴源性外胚间充质干细胞在牙齿发育过程中的骨向分化作用,而且提示可以通过调控P75NTR改变Wnt信号通路作用下颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的骨向分化能力,为组织工程化牙齿的研究提供新的理论和实验依据。