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研究目的1.本研究从不同层面观察哈它各其-7涂擦疗法对压疮缺血再灌注损伤(I/RI)大鼠的影响,初步阐明哈它各其-7涂擦疗法治疗压疮的作用及其可能机制。。2.制备压疮I/RI大鼠模型,观察哈它各其-7涂擦疗法对压疮创面病理学变化,对血清细胞因子及压疮创面组织相关基因的mRNA和蛋白表达的影响,从而探讨其创面愈合的作用机制,为临床应用与研究提供实验依据。研究方法1.动物筛选及分组:购入健康清洁级SD大鼠80只,雄性,体重为280土20g,在实验室习惯性饲养一周后造模。根据随机数字表法将大鼠随机分为假手术组,模型组,哈它各其-7组,云南白药对照组,每组各20只大鼠。2.压疮I/RI大鼠模型的复制:10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,脊柱右侧臀部处脱毛消毒。做一约2.5cm横向切口,切开全层皮肤,钝性分离,将高温灭菌后的直径为25mm×1.5mm的圆形磁铁植入大鼠臀部皮肤深筋膜下,最后用4-0丝线缝合全层切口。术后24h将一块25mm×2.5mm的永久性磁铁,吸附于实验大鼠臀部磁片植入区,并开始皮肤缺血再灌注损伤循环。外源磁铁对皮下的磁铁产生压力,造成局部组织缺血,每次缺血2h后将外源磁铁取下,让局部血流恢复30min。如此为1个循环,每日每只大鼠进行5个连续的循环,连续5天。假手术组仅在臀部相同位置做一深至深筋膜的切口即可。以皮肤变黑,变硬,针刺不出血溃疡作为判断标准。3.治疗方法:模型组、哈它各其-7组和云南白药对照组中选取符合III期压疮模型大鼠,各组16只。其中假手术组采用随机数字表法选取16只大鼠。每组又分7天、14天2个时间点,每个时间点8只大鼠。各治疗组给予相应药物外涂擦,1次/天,以无菌纱布覆盖创面,绷带固定包扎。假手术组和模型组不给予任何方式的治疗。4.取材与指标检测:①一般情况观察:观察大鼠创面愈合情况,如大鼠创面颜色、渗出液等;计算大鼠创面面积。②各组在治疗后的两个时间段麻醉大鼠,采集腹主动脉血5mL,放入不含抗凝剂的试管中,以3000r/min,4℃离心15min,根据试剂盒说明检测大鼠血清SOD、MDA、MPO、NO含量,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清TNF-α、ICAM-1水平。③压疮创面为中心,切取各组左侧创缘全层皮肤及肌肉组织,4%多聚甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋,HE染色进行观察和IHC法检测样本组织HIF-1α、VEGF蛋白表达。④压疮创面为中心,切取各组右侧创缘全层皮肤及肌肉组织,放入冻存管内,置液氮中保存后移入-80℃冰箱,RT-PCR法测样本组织中HIF-1α、VEGF mRNA及Western blot法测创面组织的HIF-1α、VEGF蛋白表达。5.统计学处理:采用SPSS21.00软件进行统计分析,数据以均数土标准差表示,多个样本均数比较采用重复测量数据的方差分析,组间两两比较采用LSD比较,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.创面大体观察哈它各其-7组大鼠创面渗出液较多,肉芽组织生长迅速,色泽鲜艳,呈淡红色,切割后出血明显。肉眼观术后第3天创面开始愈合,第14天基本愈合。云南白药组大鼠创面湿润,创面愈合比较迅速,肉芽生长迅速,色泽淡红。肉眼观术后第4天开始愈合,第14天基本愈合。模型组大鼠伤口痂和纱布粘连,需用生理盐水湿润,才能避免撕扯引起出血,伤口愈合缓慢,肉眼观术后第7天开始愈合,直到第14天愈合率仍是不高。2.哈它各其-7涂擦疗法对压疮I/RI模型大鼠创面愈合的影响各组间创面残余面积比较情况如下,给药3天,各组小鼠残余创面面积没有显著性差异(P>0.05)。给药第7天,14天时,与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药对照组有显著性差异(P<0.01)。各时间段,哈它各其-7组与云南白药对照组之间无显著性差异(P>0.05)。表明哈它各其-7组和云南白药对照组对压疮I/RI模型大鼠创面均具有较好的修复作用。3.哈它各其-7涂擦疗法对压疮I/RI模型大鼠创面组织病理变化的影响假手术组大鼠皮肤为复层鳞状上皮,上皮组织结构比较清晰,肌纤维排列紧密有序,未见明显炎症细胞浸润。模型组大鼠皮肤表面不完整,复层鳞状上皮较正常组薄,结构不清,部分上皮结构出现断裂,肌纤维明显的水肿,组织间充血严重,真皮内见较多的炎症细胞浸润。哈它各其-7组与云南白药对照组上皮结构较清晰,肌纤维水肿减轻,组织间无充血,真皮内可见少量炎性细胞浸润。说明哈它各其-7能有效减轻局部损害。4.哈它各其-7涂擦疗法对压疮I/RI模型大鼠血清SOD、MDA、NO、MPO、TNF-α、ICAM-1 的影响4.1对SOD的影响治疗的两个时间点,与假手术组比较,模型组大鼠血清SOD含量明显降低(P<0.01),与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组血清SOD含量明显升高(P<0.01)。4.2对MDA的影响治疗的两个时间点,与假手术组相比,模型组血清MDA含量明显提高(P<0.01)。与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组血清MDA含量明显降低(P<0.01)。哈它各其-7组与云南白药组MDA含量无显著性差异(P>0.05)。4.3对NO、MPO的影响治疗的两个时间点,与假手术组相比,模型组血清NO、MPO水平明显提高,具有显著性差异(P<0.01),与模型组相比,哈它各其组与云南白药组大鼠血清MPO水平明显降低(P<0.05)。与云南白药组相比,给药7天,哈它各其-7组大鼠血清MPO水平显著降低(P<0.05)4.4 对TNF-α、ICAM-1 的影响治疗的两个时间点,与假手术组相比,模型组血清TNF-α、ICAM-1含量显著升高(P<0.01),与模型组相比,哈它各其组与云南白药组大鼠血清TNF-α、ICAM-1含量显著降低(P<0.01)。与云南白药组相比,哈它各其-7组血清ICAM-1含量显著降低(P<0.05)。5.哈它各其-7涂擦疗法对压疮I/RI模型大鼠创面HIF-1α、VEGF的影响5.1RT-PCR结果:治疗的两个时间点,与假手术组比较,各组HIF-1α、VEGFmRNA水平明显提高(P<0.01),与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组HIF-1α、VEGFmRNA水平明显提高(P<0.05)。给药7天,与哈它各其-7组比较,云南白药组VEGFmRNA水平明显提高(P<0.05)。5.2 Western blot结果:治疗的两个时间点,与假手术组比较,各组HIF-1α蛋白水平明显提高(P<0.01)。与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组HIF-1α蛋白水平明显提高(P<0.01)。哈它各其-7组和云南白药组之间没有显著性差异(P>0.05)。治疗的两个时间点,与假手术组比较,各组VEGF蛋白水平提高,其中哈它各其-7组与云南白药组显著提高,具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组VEGF蛋白水平明显提高(P<0.01)。与哈它各其-7组比较,给药14天,云南白药组VEGF蛋白水平显著提高(P<0.05)。5.3 IHC结果:治疗的两个时间点，与假手术组比较,各组HIF-1α、VEGF平均光密度值明显提高(P<0.05)。与模型组比较,哈它各其-7组与云南白药组HIF-1α、VEGF平均光密度值进一步提高(P<0.05)。哈它各其-7组和云南白药组之间没有显著性差异(P>0.05)。结论1.哈它各其-7涂擦疗法能显著减小压疮I/RI模型大鼠创面面积,病理结果显示可减少创面组织的炎症细胞浸润,对创面愈合有修复作用,能有效促进创面的愈合。2.哈它各其-7涂擦疗法能提高压疮I/RI模型大鼠血清SOD的活性,降低MDA含量,降低NO含量,减轻脂质过氧化反应,提高抗氧化酶活性,清除自由基,从而促进伤口愈合。3.哈它各其-7涂擦疗法可显著降低压疮模型大鼠血清TNF-α、MPO、ICAM-1含量,其机制可能与抑制压疮引起的炎症反应有关,从而促进伤口愈合。4.哈它各其-7涂擦疗法可通过提高压疮创面组织HIF-1α及其下游因子VEGFmRNA及蛋白的表达,进而减轻缺血再灌注损伤,有效改善压疮创面局部的血液循环,促进血管及纤维组织的增生,进而促进创面的修复。