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【背景】乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤疾病,绝大多数乳腺癌患者,发现时已出现转移。目前导致乳腺癌发生和转移的机制仍不明确,其转移进展期的治疗仍然是一个巨大的挑战。尽管手术,放、化疗等传统治疗方法不断进步,但乳腺癌的发病率和死亡率并未大幅下降。因此,深入了解乳腺癌的发生发展机制,探寻新型有效的治疗策略显得尤为迫切。研究显示,趋化性细胞因子CXCR4与乳腺癌的生长和转移关系密切。拮抗CXCR4可以抑制乳腺癌的生长和转移。然而,长期应用CXCR4拮抗剂会对机体的免疫系统产生严重的副作用。而通过si RNA抑制CXCR4表达可以阻碍肿瘤生长和转移,提示这种策略也许可以成为一种潜在的抗肿瘤治疗方法。但是,如何安全有效的将si RNA递送入细胞内仍然是阻碍RNAi临床应用的巨大障碍。研究表明,20%-35%的侵袭性乳腺癌患者中HER2呈高表达,而且乳腺癌患者中HER2与CXCR4共表达率也很高。那么我们能否以HER2为靶点,靶向递送CXCR4si RNA进行体内治疗?si RNA递送入HER2+细胞后,能否有效干涉CXCR4?CXCR4的干涉能否起到抑制乳腺癌生长和转移的作用?这些问题都有待探索,本课题将就此展开研究。【目的】获得一种新型融合蛋白(e23s Fv-9R),使其同时具有抗HER2单链抗体(e23s Fv)靶向HER2+肿瘤细胞的能力和具有精氨酸九聚体(9R)携带si RNA的能力。使用e23s Fv-9R体内递送CXCR4 si RNA,进而探讨CXCR4的抑制对HER2+乳腺癌生长和转移的影响,为乳腺癌的治疗带来新思路。【方法】1.运用分子克隆技术,构建p QE30-e23s Fv-9R表达质粒;2.表达质粒在大肠杆菌中表达,表达产物经纯化复性后获得e23s Fv-9R,使用SDS-PAGE和Western Blot实验对其鉴定;3.用凝胶迁移阻滞实验对e23s Fv-9R si RNA结合能力进行验证,并通过si RNA滴定结合实验分析e23s Fv-9R能够结合si RNA分子数;4.利用乳腺癌组织芯片进行CXCR4染色,分析CXCR4与HER2表达之间的关系;5.使用q RT-PCR检测常用细胞系中CXCR4与HER2表达情况;6.通过ELISA实验、流式细胞术和间接免疫荧光实验验证e23s Fv-9R的HER2抗原结合活性;7.使用共聚焦显微镜观察e23s Fv-9R携带si RNA的细胞内化情况;8.采用q RT-PCR和Western Blot实验分析CXCR4的体外抑制效率;9.使用CCK-8实验、细胞平板克隆形成实验、流式细胞术和Transwell细胞侵袭实验分别检测CXCR4干涉对HER2+肿瘤细胞的影响;10.利用荧光成像,观测e23s Fv-9R体内分布;11.应用q RT-PCR,Western Blot和免疫组织化学实验检验CXCR4体内组织中的抑制效率;12.通过Ki-67染色和TUNEL实验检测下调CXCR4对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响;13.利用生物发光成像、肿瘤体积测量和生存分析验证e23s Fv-9R/CXCR4si对HER2+乳腺癌原位移植瘤生长和荷瘤裸鼠生存时间的影响;14.应用生物发光成像观测e23s Fv-9R/CXCR4si对HER2+乳腺癌转移的影响;15.使用q RT-PCR实验分析裸鼠肺内人类管家基因h HPRT的表达;16.通过定量ELISA实验和血清学指标分析观察给药后是否会引发小鼠内源性免疫反应或急性应激反应;17.利用HE染色观测重复给药以及5倍治疗剂量给药对小鼠重要组织器官的影响。【结果】1.酶切鉴定和测序结果证明,p QE30-e23s Fv-9R表达质粒构建成功;2.SDS-PAGE和Western Blot实验证实融合蛋白e23s Fv-9R表达、纯化、复性成功,且蛋白大小与预期一致;3.凝胶迁移阻滞实验和si RNA滴定结合实验结果证明,e23s Fv-9R可以结合si RNA,且1分子e23s Fv-`9R大约可以结合3分子si RNA;4.乳腺癌组织芯片染色结果表明,CXCR4与HER2表达具有相关性;5.根据细胞q RT-PCR结果结合细胞动物体内成瘤情况,选用HER2+BT-474细胞作为实验用阳性细胞,HER2-MDA-MB-231细胞作为对照细胞;6.ELISA实验、流式细胞术和间接免疫荧光实验结果证明e23s Fv-9R具有HER2抗原结合活性,可以携带si RNA与HER2+肿瘤细胞结合;7.共聚焦显微镜观察结果表明e23s Fv-9R可以递送si RNA进入HER2+肿瘤细胞;8.q RT-PCR和Western Blot实验结果证实e23s Fv-9R/CXCR4si可以有效干涉乳腺癌细胞CXCR4 m RNA及蛋白质表达;9.CCK-8实验和细胞平板克隆形成实验结果说明干涉CXCR4可以降低HER2+肿瘤细胞的增殖及克隆形成能力,流式细胞术凋亡检测结果证明干涉CXCR4可以诱导HER2+肿瘤细胞凋亡,Transwell细胞侵袭实验结果说明干涉CXCR4可以抑制HER2+肿瘤细胞转移;10.荧光成像结果表明,e23s Fv-9R具有良好的在体肿瘤靶向性,且可以在肿瘤内聚集36 h以上;11.q RT-PCR,Western Blot和免疫组织化学实验结果证明e23s Fv-9R/CXCR4si可以有效降低组织内CXCR4 m RNA及蛋白质表达;12.Ki-67染色和TUNEL实验结果表明干涉CXCR4可以抑制肿瘤组织增殖和诱导肿瘤细胞凋亡;13.乳腺癌原位荷瘤裸鼠的生物发光成像、肿瘤体积测量和生存分析结果表明e23s Fv-9R/CXCR4si可以抑制HER2+移植瘤生长并提高荷瘤裸鼠生存时间;14.转移瘤生物发光成像结果表明e23s Fv-9R/CXCR4si能够抑制HER2+乳腺癌转移;15.肺转移瘤内h HPRT的q RT-PCR实验分析结果也证明e23s Fv-9R/CXCR4si能够抑制HER2+乳腺癌转移;16.定量ELISA实验和血清学指标检测结果证明e23s Fv-9R/CXCR4si通过尾静脉给药不会引起小鼠出现内源性免疫反应或急性应激反应;17.组织器官HE染色未观测到明显病理变化,证明重复给药以及5倍治疗剂量给药能够被机体很好的耐受。【结论】1.构建获得了融合蛋白e23s Fv-9R,其同时具有si RNA结合和HER2抗原结合能力,并可以携带si RNA内化入HER2+乳腺癌细胞;2.体外实验中e23s Fv-9R/CXCR4si能够降低HER2+肿瘤细胞CXCR4 m RNA及蛋白表达水平,干涉CXCR4可以降低HER2+肿瘤细胞增殖和转移能力,诱导肿瘤细胞凋亡;3.体内实验中e23s Fv-9R具有良好的在体肿瘤靶向性,e23s Fv-9R/CXCR4si能够降低HER2+肿瘤组织CXCR4 m RNA及蛋白表达水平,CXCR4的下调可以抑制肿瘤增殖和转移能力,提高荷瘤裸鼠的生存时间;4.e23s Fv-9R/CXCR4si通过尾静脉系统给药可被机体耐受,在体治疗安全性良好。