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血蓝蛋白(hemocyanin)又称血蓝素,与蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)、血红蛋白(hemoglobin)并称自然界三大呼吸蛋白。血蓝蛋白主要分布在节肢动物和软体动物血淋巴中,含量非常丰富,具有运输氧气、调节渗透压、表皮固化、调节蜕皮过程、转运金属离子、储存蛋白质、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种功能。然而,近年来对于血蓝蛋白的研究多集中在其蛋白结构和功能方面,而对于血蓝蛋白的基因结构尤其是软体动物血蓝蛋白基因多亚型和其多功能之间的关系方面研究较少。本文运用基因序列分析、荧光定量PCR(qPCR)和荧光原位杂交技术(FISH)对杂色鲍(Haliotis diversicolor)血蓝蛋白的基因结构及其对病原刺激的响应等进行了研究,对深入了解软体动物血蓝蛋白这种多序列、多功能、高分子量免疫分子的基因演化和免疫响应机理具有重要的意义。首先,运用生物信息学工具软件对课题组克隆得到的杂色鲍血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1和Hd Hc2-2序列进行分析。结果显示,Hd Hc与欧洲鲍(H.tuberculata)、钥孔戚(M.Crenulata)等腹足纲动物的Hc聚为一支,遗传距离较近;Hd Hc基因结构与Ht Hc的基因结构相似,也有8个功能单元(FU-a~FU-h),FU-a、FU-f、FU-g分别由4、3、2个外显子编码,其余5个功能单元则是连续的。和欧洲鲍相同的是,Hd Hc也含有0、1、2三种内含子相位,不同的是Hd Hc1和Hd Hc2-1的7个连接内含子均是1相位,6个内部内含子中有3个0相位,1个1相位,2个2相位,而Hd Hc2-2的7个连接内含子都是0相位,6个内部内含子有1个0相位,2个1相位,3个2相位。其次,人工注射病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鲍类疱疹病毒(Abalone herpesvirus,Ab HV)刺激健康杂色鲍,检测血淋巴中可溶性总蛋白的浓度、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)活性的变化以及无细胞血浆的抑菌性,结果表明,(1)哈维弧菌和Ab HV刺激后,杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度先显著升高,后显著下降。(2)哈维弧菌和Ab HV刺激后,杂色鲍血淋巴中ACP和AKP活性显著升高,哈维弧菌刺激组的SOD先显著升高,后显著下降,Ab HV刺激组的SOD显著下降。(3)杂色鲍无细胞血淋巴对哈维氏弧菌、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliiluyitcus)这三种病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明病原刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。然而,作为血淋巴中含量最高的一种免疫分子,血蓝蛋白的表达可能也受到了调控。运用荧光定量PCR(qPCR)技术检测鲍胚胎发育各时期以及哈维氏弧菌,溶珊瑚弧菌,Ab HV,Poly(I:C)刺激后杂色鲍腹足、外套膜、鳃、肝胰腺中血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1和Hd Hc2-2相对表达量的变化,从而分析其与血淋巴免疫活性变化的关系。结果显示:(1)血蓝蛋白两个基因Hd Hc1、Hd Hc2-1在杂色鲍的发育初期即有表达,Hd Hc2-1的相对表达量高于Hd Hc1的表达量,未见Hd Hc2-2的表达。(2)哈维氏弧菌、溶珊瑚弧菌、Ab HV、Poly(I:C)刺激杂色鲍后,腹足、肝胰腺、鳃、外套膜中的血蓝蛋白基因Hd Hc1、Hd Hc2-1的相对表达量均有变化,但是不同组织、不同刺激组的变化规律不同。与0 h的空白对照组相比,哈维氏弧菌刺激组Hd Hc1表达量先升高后降低,Hd Hc2-1表达量先降低后升高再降低;溶珊瑚弧菌刺激组Hd Hc1表达量呈降低趋势,Hd Hc2-1表达量升高降低再升高;Ab HV刺激组Hd Hc1表达量先降低后升高再降低,Hd Hc2-1表达量先降低后升高再降低;Poly(I:C)刺激组Hd Hc1表达量先降低,在48 h突然升高,然后再降低,Hd Hc2-1表达量先降低在48 h突然升高,然后再降低;注射PBS的对照组:Hd Hc1和Hd Hc2-1表达量变化趋势相同,均是先升高后降低;注射PBS的对照组以及四个刺激组的杂色鲍的4种组织中均未检测到Hd Hc2-2的表达。根据qPCR结果,进一步运用FISH技术对外界刺激后血蓝蛋白基因在组织中的具体表达部位进行了研究。Poly(I:C)刺激48 h后腹足中的Hd Hc的FISH结果表明,Hd Hc1阳性信号主要集中在腹足的边缘处,即接触环境的那一侧,而腹足肌肉的内部Hd Hc1阳性信号较少;腹足边缘Hd Hc2-1的阳性信号明显少于Hd Hc1,腹足肌肉内部的Hd Hc2-1的阳性信号也成零星分布。综上所述,杂色鲍血蓝蛋白与欧洲鲍血蓝蛋白亲缘关系最近,软体动物血蓝蛋白不同亚基的进化早于种属的进化,Hd Hc2-2可能是假基因。杂色鲍血蓝蛋白基因Hd Hc1和Hd Hc2-1为诱导型表达基因,参与了幼体发育、抗细菌及抗病毒的免疫过程;细菌和病毒刺激后,杂色鲍无细胞血浆的抑菌性显著增强可能与血蓝蛋白的表达调控有关。