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乳房炎是制约奶牛产业发展最严重的疾病之一,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是造成隐性乳房炎主要的细菌之一。在乳腺组织中,乳腺上皮细胞在牛奶分泌和先天免疫系统中具有重要作用。研究表明S.aureus可激活乳腺上皮细胞炎症相关信号通路,同时可影响免疫细胞的激活、分化或迁移等,其中miRNAs(microRNAs,miRNAs)具有重要调控作用。外泌体是具有细胞间通讯功能的纳米级胞外囊泡,且已被证实存在于牛奶以及细胞上清液中。但是S.aureus影响牛奶或乳腺上皮细胞来源外泌体miRNAs的研究较少,且炎症状态下乳腺上皮细胞与免疫细胞之间的通讯机制也并不清楚。因此,本研究分别利用S.aureus或磷脂壁酸(Lipoteichoic acid,LTA)感染乳腺组织和乳腺上皮细胞,筛选炎症相关的miRNAs,探究miRNAs在炎症反应中的调控机制,阐明乳腺上皮细胞和巨噬细胞之间的调节途径。本研究分别从健康(HH)和乳房炎(HM)的牛奶中分离外泌体,用miRNA-seq技术对炎症相关miRNAs进行筛选及功能分析;然后,利用S.aureus来源LTA构建炎症细胞模型,分析了细胞和外泌体中miRNAs的表达,探讨了细胞中特异高表达的miR-23a在炎症过程中的调控作用,同时初步研究了外泌体对巨噬细胞的影响;最后,利用荧光定量、流式细胞检测以及miRNA过表达和抑制表达等技术分析乳腺上皮细胞来源外泌体miR-221对巨噬细胞极化的影响。本研究主要结果如下:(1)用透射电镜、Nanosight和Western blot鉴定所得囊泡符合外泌体经典特征。由此,构建了6个miRNA-seq文库,共鉴定了1472个miRNAs,包括492个已知和980个新预测miRNAs。对已知miRNAs表达模式分析发现,少量高表达miRNAs占全部miRNAs的80%左右。在HH和HM中共鉴定出18个差异表达分析miRNAs,且主要参与疾病、免疫和炎症的调节。(2)40μg/mL LTA感染奶牛乳腺上皮细胞6 h后,炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA表达水平显著升高,且其浓度均随时间延长而增高。LTA感染3 h后TLR2和MyD88mRNA表达水平均显著升高。蛋白表达分析发现,LTA通过与TLR2结合,激活PI3K/AKT信号通路,促进细胞炎症反应。然而,TLR2抑制剂OxPAPC处理后,PI3K/AKT信号通路不能被激活,表明TLR2在LTA诱导的炎症反应中具有不可或缺的作用。(3)对14个筛选的炎症相关miRNAs研究发现,LTA感染3 h时miRNAs表达水平显著升高,且随后呈降低趋势,其中miR-23a在3 h和24 h极显著升高。另外,LTA处理后,11个外泌体来源miRNAs在24 h表达升高(其中miR-221上升最高),3个miRNAs表达降低。对miR-23a靶基因预测和KEGG pathway富集分析发现,其主要参与JAK/STAT、PI3K/AKT以及MAPK等炎症相关信号通路。双荧光素酶报告系统检测发现,miR-23a直接靶向PI3K 3’UTR。miR-23a过表达和抑制表达试验发现,miR-23a可通过靶向PI3K激活或抑制PI3K/AKT信号通路,参与细胞炎症反应的调节。将外泌体与牛外周血巨噬细胞共培养,发现细胞表面蛋白CD11b表达水平升高,TNF-α和iNOS mRNA表达水平升高,而Arg-1 mRNA表达水平降低,表明该外泌体促进巨噬细胞向M1型极化。(4)利用小鼠乳腺上皮细胞系(HC11)和巨噬细胞(RAW264.7)体外模拟细胞间通讯研究发现,LTA感染12 h后HC11来源外泌体中miR-221表达极显著升高,且与RAW264.7共培养后,巨噬细胞中miR-221极显著高表达。同时,巨噬细胞TNF-αmRNA表达上调,Arg-1 mRNA表达下调,细胞膜蛋白CD11b和CD206表达分别升高和降低。miR-221过表达和抑制表达后,Exo(mimic)和Exo(inhibitor)中miR-221的水平分别极显著升高和降低。Exo(mimic)和Exo(inhibitor)与巨噬细胞共培养后,分别可促进和抑制巨噬细胞向M1型极化。靶基因分析发现,miR-221与SOCS1靶向结合。通过对JAK/STAT信号通路中STAT1、STAT3和STAT6磷酸化蛋白表达水平研究发现,SOCS1通过调节STAT1和STAT3影响巨噬细胞极化,而在此过程中,STAT6的磷酸化并未发生显著变化。综上所述,LTA感染的乳腺上皮细胞可分泌高表达miR-221的外泌体,且被巨噬细胞摄入,靶向SOCS1参与JAK-STAT信号通路的调节,促进巨噬细胞向M1型极化。综上所述,本试验在奶牛乳房炎体内和体外模型中,筛选并鉴定了miR-23a在S.aureus引起的炎症反应中的调控作用,并阐明了乳腺上皮细胞通过分泌包含高表达miR-221的外泌体影响巨噬细胞极化的细胞间调节机制,为深入揭示S.aureus引起的奶牛乳房炎形成的分子机制提供理论基础,也为奶牛乳房炎抗病育种提供数据支撑。