论文部分内容阅读
目的:PKR(dsRNA-dependent protein kinase)是胞内模式识别受体,也是丝/苏蛋白激酶,被发现参与了外周组织的胰岛素抵抗(insulin resistance),和中心组织胰岛β细胞周期阻滞,在调控机体胰岛β细胞整体功能失代偿和2型糖尿病发生过程中具有至关重要的作用。除了激酶活性,PKR还有蛋白结合功能,而其对胰岛β细胞功能的调节并不清楚。本研究旨在探讨PKR蛋白结合功能对胰岛β细胞增殖的分子机制。方法:采用Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短体体系,在胰岛β细胞(MIN6细胞和原代胰岛)中构建PKR蛋白结合功能上调模型,即在激酶活性未活化的情况下,单因素研究PKR蛋白结合功能。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)检测PKR与TRAF2/3/6的蛋白结合变化;免疫印迹检测PKR过表达后其底物eIFα的磷酸化水平。噻唑蓝(MTT)法、EdU荧光标记和流式细胞术分别评价胰岛β细胞的生长活力、细胞增殖及周期进程的变化。Real-time RT-PCR和Western blot实验分别测定细胞周期蛋白cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4、c-Myc和p21、p27以及p53的mRNA和蛋白水平。转染si-c-Myc,si-TRAF2,si-TRAF6,si-RIP1的小干扰RNA或给予NFκB抑制剂(Bay11-7082)预处理;核质分离研究细胞核p65的蛋白水平;免疫荧光实验观察NFκB(p65)的亚细胞结构定位;荧光素酶报告基因实验(Luciferase Assay)分析NFκB的转录活性。转染全长PKR-K296R后,辨析糖脂毒性或炎症因子刺激对MIN6细胞PKR蛋白结合功能的影响。结果:Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短体体系成功构建了胰岛β细胞无激酶活性的PKR蛋白结合功能上调模型;PKR蛋白结合功能可以促进胰岛β细胞生存活力,增殖和G1/S期转换;并能诱导c-Myc的m RNA和蛋白水平显著上调,而对cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4和p21、p27以及p53无明显影响;c-Myc的上调依赖于NFκB的转录活性;而PKR蛋白结合功能上调伴随NFκB的活化;si-TRAF2而不是si-TRAF6能显著阻断PKR蛋白结合功能介导的NFκB转录活性、c-myc上调和胰岛β细胞增殖;PKR蛋白结合功能也能诱导RIP1的泛素化并参与TRAF2调控的胰岛β细胞促增殖作用;而PKR蛋白结合功能也能缓解糖脂毒性和炎症因子诱导的胰岛β细胞生长抑制。结论:PKR蛋白结合结合功能能通过促进细胞周期G1/S转化来刺激胰岛β细胞增殖,这与周期相关蛋白c-Myc的表达上调密切联系。NFκB的转录活性参与了PKR蛋白结合功能诱导的c-Myc基因表达;PKR通过募集TRAF2来激活下游信号分子,泛素化RIP1并激活NFκB转录活性。本论文研究揭示了PKR蛋白结合功能通过TRAF2/RIP1/NFκB/c-Myc信号通路,促进胰岛β细胞增殖的新调控机制。结合我们已有的研究,抑制或下调PKR的激酶活性,而保留PKR蛋白结合功能,能促进胰岛β细胞增殖,为改善2型糖尿病的药物治疗提供新的思路。