甲壳动物的个体发育伴随有周期性的蜕皮过程，该过程由蜕皮抑制激素fMolt-inhibiting hormone，MIH)和蜕皮激素(ecdysone)相互拮抗来调控。MIH属于甲壳动物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族神经肽。除MIH外，CHH家族神经肽还包括高血糖激素、性腺抑制激素(Gonad-inhibiting hormone，GIH)和大颚器官抑制激素(Mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH)。这些激素成熟肽的分子量约7-9 kD，通常由70-78个氨基酸残基组成，氨基酸序列相似，均有6个保守的半胱氨酸残基，形成3个二硫键。该家族神经肽由甲壳动物的眼柄X-器官窦腺复合体合成和分泌，具有调节甲壳动物的血糖以及调控生殖、生长和发育等重要生理过程的功能。 尽管最近在MIH的结构和功能的理解上取得了一些进展，但仍有许多重要的问题有待回答。MIH详细的作用机制还不清楚，在生长发育过程中的表达情况也还不十分清楚。为确定MIH的结构、功能和分子作用机制，我们进行了Ers-MIHl基因的体外表达的研究，并对融合蛋白进行了初步纯化、鉴定及复性，制备了相应的多克隆抗体。 第一章：甲壳动物眼柄神经激素的研究概述 虾蟹类眼柄内分泌系统主要由类似于脊椎动物的下丘脑神经垂体系统的X-器官窦腺复合体(x-organ sinus gland complex)组成，能够合成一些调控生殖、发育和蜕皮的神经激素。目前已从虾蟹类甲壳动物的眼柄中分离纯化出6种激素，均为肽类激素。本章主要对虾蟹类的眼柄神经内分泌系统的结构、激素的种类及其生理生化特性，特别是基因结构及克隆等方面作了综述，为进一步开展虾蟹类内分泌学研究提供参考资料。 第二章：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIHl)基因的原核表达载体的构建 蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)属甲壳动物高血糖激素(cmstaceanhyperglycemic hormone，CHH)家族。MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。本研究用DNA重组技术，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt-inhibiting hormone-1，Ers-MIHl)基因序列设计引物进行PCR扩增，经TA克隆测序鉴定后，用BamHI，Hind Ⅲ双酶切，并纯化目的片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中。用PCR结合双酶切的方法鉴定阳性克隆，并通过核酸测序验证。结果显示成功构建了原核表达载体pET-MIHl。 第三章：Ers-MIHl基因融合蛋白在大肠杆菌中的表达 将构建好的原核表达质粒pET-MIHl转入表达菌株BL21(DE3)中，37℃终浓度为1mmol／L的IPTG下不同时间诱导表达，得到pET-MIHl的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，诱导3 h发现有大量pET-MIHI融合蛋白表达，在分子量为12 kD处有1条特异的蛋白条带。融合蛋白表达产物分布显示，多数以包涵体形式存在于超声波破碎处理后的沉淀中。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH的功能和分子作用机制奠定了基础。 第四章：Ers-MIHl基因融合蛋白的纯化与复性研究 将诱导表达的重组蛋白pET-MIHl菌液，经过超声波破碎处理后，收集上清和沉淀，并分别进行纯化。对于上清可溶性蛋白的亲和层析柱纯化并未获得较高纯度的目的蛋白。通过对包涵体的洗涤、变性、复性以及进一步的纯化的摸索，期望获得较高纯度的具有活性的重组蛋白MItI，用于后续功能的研究。 第五章：Ers-MIHl多克隆抗体的制备 以8 mol／L尿素溶解的pET-MIHl包涵体作为免疫原，免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体。获得了高效价(1:10 000)抗体，ELISA和Western blot的结果表明制备的抗体效价高、特异性强。 第六章：中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIHl)基因的真核表达载体的构建根据真核表达载体毕赤酵母pPIC9的多克隆酶切位点，设计引物扩增获得Ers-MIHl基因成熟肽部分序列。经TA克隆测序鉴定后，提取质粒并双酶切后纯化目的片段克隆到真核表达载体pPIC9中，用PCR结合双酶切的方法鉴定，核酸测序验证。重组质粒pPIC9-MIHl双酶切后得到预计大小的目的片段，测序结果显示插入基因为目的基因，未发生基因读码框移。成功构建了真核表达载体。在引物设计时加入6His纯化标签，为后续重组蛋白的表达鉴定与纯化提供方便。