论文部分内容阅读
随着人类城市化和工业化水平的加快，人们对能源的需求越来越大。随着化石能源的快速消耗、不可再生和其在使用过程中造成的空气污染等问题越来越严重，寻找新的清洁可再生能源成为近些年科研人员研究的重点。在众多可再生能源中，氢气由于具有高燃烧值及燃烧产物无污染两大特性受到许多研究者青睐。本课题组筛选的ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27主要代谢产物有乙醇、乳酸、乙酸和氢气。该菌不仅可以利用多种碳源，甚至可以直接利用半纤维素进行代谢产物的合成及共利用戊糖和己糖，显示出突出的应用前景。但其氢气产量和得率仍不足以使之成为工业发酵菌株，因此，为提高菌株氢气产量和得率，需对其进行代谢工程改造。
T.aotearoenseSCUT27在合成乙醇、乳酸和氢气的过程中均需NADH提供电子，因此本研究首先从提高细胞内NADH的供给着手提高其氢气产量。在T.aotearoenseSCUT27中，NADH依赖的还原态铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(NADH-dependentreducedferredoxin:NADP+oxidoreductase，NfnAB)催化电子从NADH和还原态铁氧还蛋白上转移到NADP+从而合成NADPH的过程，阻断该反应理论上可提高菌株胞内NADH的浓度。同源重组敲除T.aotearoenseSCUT27nfnAB基因，得到工程菌SCUT27/?nfnAB。该工程菌与SCUT27相比，以葡萄糖、木糖或者葡萄糖/木糖混合糖分别为碳源时氢气产量均能提高40%以上。SCUT27/?nfnAB和SCUT27胞内NADH/NAD+比例结果显示，发酵过程中SCUT27/?nfnAB胞内NADH/NAD+比例一直高于SCUT27。随后以6种木质纤维素稀硫酸水解液为碳源进行摇瓶发酵，结果表明SCUT27/?nfnAB和SCUT27均能利用6种木质纤维素水解液，工程菌的氢气产量均显著高于野生型菌株。以水稻秸秆和玉米芯水解液为碳源时，SCUT27/?nfnAB氢气产量分别达到62.39±3.45mmol/L和69.76±2.78mmol/L；SCUT27/?nfnAB在5-L发酵罐中以水稻秸秆水解液为底物时其氢气产量达209.31mmol/L。
双功能醛醇脱氢酶(Bifunctional alcohol and aldehyde dehydrogenase，AdhE)催化T.aotearoenseSCUT27中乙醇的合成，有研究显示对adhE基因进行定点突变可改变AdhE的辅因子偏好性。因此，本研究结合文献选择位点对adhE基因进行定点突变后得到工程菌SCUT27/adhEG544D，氢气产量达45.74mmol/L，比SCUT27提高33.94%。随后敲除SCUT27/adhEG544D菌株中的nfnAB基因来进一步提高其氢气产量，得到的工程菌SCUT27/adhEG544D/?nfnAB氢气产量与SCUT27/adhEG544D、SCUT27/?nfnAB和SCUT27相比分别提高34.31%、20.66%和74.11%。随后向培养基中添加Fe/C化合物，SCUT27/adhEG544D/?nfnAB发酵体系中氢气产量达到68.38±3.74mmol/L，与不添加Fe/C化合物相比提高15.51%。
接下来探究在T.aotearoenseSCUT27中表达其自身或者外源与氢气合成相关基因对菌株氢气产量的影响。所选的5个基因分别为：T.aotearoensehfsB氢化酶和hydG成熟酶基因及ClostridiumthermocellumhydG成熟酶基因hydGc、[FeFe]-氢化酶基因和ech氢化酶基因。以上基因在T.aotearoenseSCUT27中单独表达均能提高菌株氢气产量，其中内源hfsB基因、外源hydGc基因和FeFec基因单独表达菌株氢气产量分别提高17.37%，25.82%和17.82%。随后将内源hfsB基因和外源hydGc基因串联表达，工程菌SCUT27/hfsB/hydGc氢气产量达到49.84±2.96mmol/L，与SCUT27相比提高45.05%。
随后将Cre/lox系统引入T.aotearoenseSCUT27中，使得可对T.aotearoenseSCUT27进行多次代谢工程改造，并对该系统操作流程进行简化。随后结合前三章研究结果构建了一系列工程菌，其中工程菌SCUT27/adhEG544D/?nfnAB/?ldh/hfsB/hydGc氢气产量达到148.67±9.65mmol/L，与出发菌株SCUT27/adhEG544D/△nfnAB相比提高152%，与SCUT27/adhEG544D/?nfnAB/?ldh相比提高33.29%，与SCUT27相比提高332.67%。其氢气得率达到2.58mol/mol葡萄糖，该得率与T.aotearoenseSCUT27野生菌株相比提高115%。
综上，本研究从不同角度对T.aotearoenseSCUT27进行改造，提高了其氢气产量，为微生物发酵产氢的代谢工程改造提供了新思路。
T.aotearoenseSCUT27在合成乙醇、乳酸和氢气的过程中均需NADH提供电子，因此本研究首先从提高细胞内NADH的供给着手提高其氢气产量。在T.aotearoenseSCUT27中，NADH依赖的还原态铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(NADH-dependentreducedferredoxin:NADP+oxidoreductase，NfnAB)催化电子从NADH和还原态铁氧还蛋白上转移到NADP+从而合成NADPH的过程，阻断该反应理论上可提高菌株胞内NADH的浓度。同源重组敲除T.aotearoenseSCUT27nfnAB基因，得到工程菌SCUT27/?nfnAB。该工程菌与SCUT27相比，以葡萄糖、木糖或者葡萄糖/木糖混合糖分别为碳源时氢气产量均能提高40%以上。SCUT27/?nfnAB和SCUT27胞内NADH/NAD+比例结果显示，发酵过程中SCUT27/?nfnAB胞内NADH/NAD+比例一直高于SCUT27。随后以6种木质纤维素稀硫酸水解液为碳源进行摇瓶发酵，结果表明SCUT27/?nfnAB和SCUT27均能利用6种木质纤维素水解液，工程菌的氢气产量均显著高于野生型菌株。以水稻秸秆和玉米芯水解液为碳源时，SCUT27/?nfnAB氢气产量分别达到62.39±3.45mmol/L和69.76±2.78mmol/L；SCUT27/?nfnAB在5-L发酵罐中以水稻秸秆水解液为底物时其氢气产量达209.31mmol/L。
双功能醛醇脱氢酶(Bifunctional alcohol and aldehyde dehydrogenase，AdhE)催化T.aotearoenseSCUT27中乙醇的合成，有研究显示对adhE基因进行定点突变可改变AdhE的辅因子偏好性。因此，本研究结合文献选择位点对adhE基因进行定点突变后得到工程菌SCUT27/adhEG544D，氢气产量达45.74mmol/L，比SCUT27提高33.94%。随后敲除SCUT27/adhEG544D菌株中的nfnAB基因来进一步提高其氢气产量，得到的工程菌SCUT27/adhEG544D/?nfnAB氢气产量与SCUT27/adhEG544D、SCUT27/?nfnAB和SCUT27相比分别提高34.31%、20.66%和74.11%。随后向培养基中添加Fe/C化合物，SCUT27/adhEG544D/?nfnAB发酵体系中氢气产量达到68.38±3.74mmol/L，与不添加Fe/C化合物相比提高15.51%。
接下来探究在T.aotearoenseSCUT27中表达其自身或者外源与氢气合成相关基因对菌株氢气产量的影响。所选的5个基因分别为：T.aotearoensehfsB氢化酶和hydG成熟酶基因及ClostridiumthermocellumhydG成熟酶基因hydGc、[FeFe]-氢化酶基因和ech氢化酶基因。以上基因在T.aotearoenseSCUT27中单独表达均能提高菌株氢气产量，其中内源hfsB基因、外源hydGc基因和FeFec基因单独表达菌株氢气产量分别提高17.37%，25.82%和17.82%。随后将内源hfsB基因和外源hydGc基因串联表达，工程菌SCUT27/hfsB/hydGc氢气产量达到49.84±2.96mmol/L，与SCUT27相比提高45.05%。
随后将Cre/lox系统引入T.aotearoenseSCUT27中，使得可对T.aotearoenseSCUT27进行多次代谢工程改造，并对该系统操作流程进行简化。随后结合前三章研究结果构建了一系列工程菌，其中工程菌SCUT27/adhEG544D/?nfnAB/?ldh/hfsB/hydGc氢气产量达到148.67±9.65mmol/L，与出发菌株SCUT27/adhEG544D/△nfnAB相比提高152%，与SCUT27/adhEG544D/?nfnAB/?ldh相比提高33.29%，与SCUT27相比提高332.67%。其氢气得率达到2.58mol/mol葡萄糖，该得率与T.aotearoenseSCUT27野生菌株相比提高115%。
综上，本研究从不同角度对T.aotearoenseSCUT27进行改造，提高了其氢气产量，为微生物发酵产氢的代谢工程改造提供了新思路。