目的1、研制一种能够用于眼库角膜保存的中期保存液。2、进一步探讨bFGF及SH在角膜中期保存液中的作用及其有效浓度。3、通过活体动物实验及对临床手术病例的初步观察,评价该保存液的效果及应用价值。本实验分三部分:⑴改良中期保存液的研制及对角膜内皮细胞的保护作用;⑵应用改良中期保存液保存角膜的活体动物实验;⑶应用改良中期保存液保存角膜的临床初步观察。方法⑴改良中期保存液的研制:在以基础培养基MEM、M-199为主要成分,添加6%葡聚糖、HEPES缓冲系、抗生素等制成角膜保存液的基础上,加入SH和bFGF,并按其浓度分为A(SH0.03% bFGF 20ng/ml)、B(SH 0.05%bFGF 50ng/ml)、C(SH0.1% bFGF 100ng/ml)、D(SH 0.2% bFGF 200ng/ml)四个实验组及E组对照组(未加SH及bFGF)。各组于4℃下保存新西兰大白兔角膜,于3、5、7、10、14天,30-34℃复温后,行大体及裂隙灯检查、苔盼兰-茜素红染色、角膜组织病理切片及扫描电镜观察检测角膜内皮细胞活性,评价保存质量。保存液存放期间定期行细菌学检测,评价其生物安全性。⑵应用改良中期保存液保存角膜的动物活体实验:将D组(SH 0.2% bFGF 200ng/ml)保存液保存兔角膜3、5、7、9天(各2片)后,用于异体兔穿透性角膜移植术(各1只兔),术后每天观察保存植片透明度、前房反应、缝线情况等,评价术后效果。⑶应用改良中期保存液保存角膜的临床初步研究:将D组(SH 0.2% bFGF 200ng/ml)保存液用于保存供体角膜,在保存1-4天后初步用于临床穿透性角膜移植术,术后7-14天内对植片透明度、视力、并发证等进行观察,评价临床效果。结果⑴第一部分:通过大体形态及裂隙灯的观察,各组(各10片)保存液澄清,透明,无混浊、沉淀。短期内各组角膜片透明,无水肿及增厚,各层结构清晰;随着时间的进展,A、B、C组角膜片开始逐渐水肿,透明度降低, D组角膜片透明,无水肿, E组水肿程度最重,各层结构基本模糊;晚期, A、B、C组角膜片水肿,混浊, D组角膜片基本透明,轻水肿,基质层稍增厚, E组严重水肿,结构模糊。角膜内皮细胞苔盼兰-茜素红染色活性细胞百分率比较,D组各时间段均显示最高,E组(对照组)最差,各组于不同保存时间段比较具有显著性差异(P<0.0001)。角膜组织病理切片亦看出各组的改变具有明显的差异性,各实验组均好于对照组,以D组效果最好。对在D组保存7天的角膜行超微结构观察,可见细胞连接基本完整,微绒毛存在,细胞膜无明显破损。保存液放置期间,各时间段行渗透压检测均稳定在330 mmol/L-340 mmol/L,PH值稳定在7.2-7.4,颜色、粘稠度均无明显改变;各时间段细菌学培养,结果均为阴性,该保存液安全、可靠,符合生物制品临床使用相关标准。⑵第二部分:将在D组保存5、6、7、9天的兔角膜行活体兔角膜移植术(各2只),术后每天观察角膜植片至30天,角膜植片均透明,前房反应轻,手术效果肯定。⑶第三部分:对供体角膜进行保存1-4天后行临床穿透性角膜移植术,对32例病例观察,角膜植片透明,患者均有不同程度的视力提高,住院期间未发现免疫排斥反应、角膜新生血管、继发性青光眼、眼内炎等并发症,临床证明安全、有效。结论自制以MEM、M-199为主要成分,含0.2%SH、200ng/mlbFGF、6%葡聚糖、HEPES缓冲系及抗生素等成分的角膜中期保存液,可明显提高保存角膜的质量,延长保存时间;通过活体动物实验及初步临床观察证实,该保存液能有效保存角膜植片7-10天,保存效果较好,且安全无毒、配制简单、成本低廉,可用于眼库角膜保存。