桦褐孔菌(Ionotus obliquus)是一种天然的药用真菌,已经被广泛研究开发并应用于药品和食品的研究中。该药用真菌中化学成分类型丰富,如三萜、甾类、多酚、多糖等,其中三萜类成分具有极其显著的抗肿瘤等药理活性。目前,国内外对桦褐孔菌中三萜成分提取分离工艺的文献报道较少,均采用传统的有机溶剂提取与柱层析分离获得三萜化合物单体,存在操作繁琐、费时费力等缺点。本实验率先采用酶诱导结合负压空化提取技术对桦褐孔菌中的三萜化合物进行了高效的提取,并利用大孔吸附树脂对桦褐孔菌中的三萜化合物进行了有效的富集,最后利用高速逆流色谱对三萜化合物单体成分进行了分离纯化,得到4种三萜化合物单体。本研究系统地建立了一套对桦褐孔菌中三萜化合物的高效提取分离新工艺,为桦褐孔菌资源的深度开发利用提供了科学基础,并具有重要的应用潜力。本论文的研究结果如下:1.采用单因素实验和Box-Behnken(BBD)实验设计对酶诱导结合负压空化方法提取桦褐孔菌中三萜化合物的工艺参数进行考察以及优化,确定最优的提取工艺参数:酶种类:纤维素酶酶浓度:1 mg/mL诱导温度:40℃诱导时间:24 h在最佳酶诱导条件下进行了实验,诱导后的桦褐孔菌粉末中三萜化合物的含量为16.35 mg/g,比未经酶诱导的桦褐孔菌中三萜化合物的含量提高了 28.13%。提取溶剂:75%乙醇溶液提取压力:-0.08 Mpa液固比:16提取温度:43℃提取时间:30 min在上述优化条件下进行了实验,对经酶诱导得到的桦褐孔菌粉末进行了提取,三萜化合物的提取率为17.41mg/g(n=3),相对标准偏差(RSD)是0.85%。2.采用大孔吸附树脂对桦褐孔菌粗提物中的三萜化合物进行富集纯化,确定了最优的工艺条件:树脂类型:AB-8样晶体积:8/3 BV样品浓度:1 mg/mL上样流速:1 BV/h除杂解吸液浓度:60%乙醇溶液除杂解吸液体积:3 BV洗脱解吸液浓度:90%乙醇溶液洗脱解吸液体积:4.5 BV在上述优化条件下,得到三萜化合物的回收率为85.92%,含量达53.26%,是富集前的4.67倍。3.利用高速逆流色谱对桦褐孔菌中三萜化合物进行分离,优化得到了最优条件参数:分离溶剂体系:正己烷-乙腈(1:1;v/v)固定相:上相流动相:下相温度:25 ℃主机转速:800 rpm流动相流速:1 mL/min在上述优化条件下,经过一次等梯度的分离,在5小时内得到4个化合物,包括3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇,得率分别为0.10 mg/g、0.13 mg/g、0.35 mg/g、0.17 mg/g,回收率分别为 93.1%、95.2%、97.8%、98.1%,纯度均在95%以上。综上所述,本论文利用酶诱导结合负压空化提取三萜化合物的得率为17.41mg/g,大孔吸附树脂富集三萜化合物含量为53.26%,并利用高速逆流色谱分离得到3β-hydroxy-lanosta-8,24-diene-21-al、inoterpene F、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇四种三萜化合物单体。本研究获得了一种高效、快速、可靠的桦褐孔菌中三萜化合物的提取、富集以及分离纯化的新工艺,同时为其他植物资源中的次生代谢产物的制备利用提供了有效的技术支撑。