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目的:初步观察成人原发性肾病综合征(PNS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中t-复合多肽1(TCP-1)、MAML2基因mRNA的表达与PNS发病的关系及其与糖皮质激素抵抗的关系,为进一步探讨TCP-1、MAML2参与PNS发病机制及糖皮质激素抵抗机制提供部分实验依据。
方法:(1)采用随机病例-对照研究,对照组(A组):健康个体30例；病例组(B组):初诊PNS患者75例(根据患者对GC反应性分B1、B2两个亚组:B1组为GC敏感患者38例,B2组为GC抵抗患者31例,失访6例),均于清晨抗凝管采集新鲜外周静脉血5ml,经聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)密度梯度离心法分离PBMC。(2)采用反转录酶.聚合酶链反应(RT-PCR)扩增每例标本PBMC中TCP-1、MAML2基因的mRNA,2％琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物,用定量分析软件Quantity One检测凝胶电泳条带的光密度值,以人的GAPDH为内参,计算TCP-1、MAML2基因mRNA的相对表达值。(3)回收凝胶目的条带送测序,在基因库(Genbank)中通过BLAST软件与已知的TCP-1、MAML2基因序列进行同源性比较,验证目的片段,排除假阳性。
结果:(1)各标本RNA样品质量:RNA纯度:OD260／280:1.8～2.0；RNA浓度:36.8～68.71ng／μl。RNA完整性:总RNA的28S和18S条带清晰,5S条带模糊；28S:18S>1,含量比例正常,5S较少。(2)回收凝胶电泳条带测序:与Genebank中已知的TCP-1基因和MAML2基因序列进行同源性比较均达99％。(3)TCP-1基因mRNA的表达结果:对照组(A组)的TCP-1基因mRNA表达强,病例组(B组)较A组表达显著减弱,差异有统计学意义(P<0.01)；而GC抵抗组(B2组)的TCP-1基因mRNA较GC敏感组(B1组)表达显著增强,差异有统计学意义(P<0.01)。(4)MAML2基因mRNA的表达结果:对照组(A组)、病例组(B组)的阳性表达率分别是70％和64％,表达差异无统计学意义(P>0.05)；GC敏感组(B1组)、GC抵抗组(B2组)的阳性表达率分别是89.47％和29.03％。B1组表达明显高于B2组,A组介于B1组、B2组之间,表达差异有统计学意义(P<0.01)。
结论:(1)在PNS患者中TCP-1基因mRNA表达较正常对照组减弱,提示TCP-1通过使其mRNA表达减弱,可能参与了PNS的发病。(2)TCP-1基因mRNA在PNS中处于低表达水平,而GC抵抗患者中其表达量较GC敏感相对增加,推测在PNS中TCP-1基因mRNA表达量相对增加,可能与糖皮质激素抵抗存在一定相关性。(3)在PNS患者中MAML2基因mRNA表达较正常对照组无差异,而在GC抵抗患者中表达较GC敏感者明显降低,推测MAML2基因mRNA的低表达,可能与糖皮质激素抵抗存在一定相关性。