【摘 要】
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研究背景金龙胶囊是由守宫、金钱白花蛇、蕲蛇以2:1:1的配方组合而成动物鲜药制剂,用于治疗多种癌症。金钱白花蛇是其中的重要组成部分,但市场中出现伪品和混伪品众多,需要对其进行质量控制,以保证用药安全。目前,金龙胶囊建立的含量测定方法中的检测成分多缺乏专属性,而其中的金钱白花蛇组分缺乏质量控制,指标成分不明,质量控制标准还有待提高。本研究提出运用分子生物学的技术对金龙胶囊中的金钱白花蛇进行质量控制。
【基金项目】
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课题来源:国家自然科学基金项目81573540； 建生鲜药创研基金项目 JSJC-2019-01-03-045； 建生鲜药创研基金项目 JSJC-20200102-054； 南方医科大学科技开发培育计划项目CX2016N004；
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研究背景金龙胶囊是由守宫、金钱白花蛇、蕲蛇以2:1:1的配方组合而成动物鲜药制剂,用于治疗多种癌症。金钱白花蛇是其中的重要组成部分,但市场中出现伪品和混伪品众多,需要对其进行质量控制,以保证用药安全。目前,金龙胶囊建立的含量测定方法中的检测成分多缺乏专属性,而其中的金钱白花蛇组分缺乏质量控制,指标成分不明,质量控制标准还有待提高。本研究提出运用分子生物学的技术对金龙胶囊中的金钱白花蛇进行质量控制。研究目的1.建立一种适合金龙胶囊的DNA提取方法。2.利用基于探针法的荧光定量PCR技术,建立一种金龙胶囊中金钱白花蛇的分子定量方法。3.利用建立的荧光定量PCR法,建立一种鲜、干金钱白花蛇的鉴别方法。4.建立不依赖于PCR的宏基因组分析鉴定法,探讨该技术一步鉴定中成药中多个组分的可行性。研究方法1.通过对五种不同的DNA提取方法进行考察,并通过浓度纯度测定、特异PCR扩增、测序等对提取效果进行考察,找到适合金龙胶囊的DNA提取方法。2.设计金钱白花蛇的特异性探针和引物,建立一种金钱白花蛇的分子定量方法,并进行方法学考察,应用该方法检测市售金龙胶囊中金钱白花蛇成分。3.运用荧光定量PCR法对鲜、干金钱白花蛇的特异片段的拷贝数进行检测,分析拷贝数的差异,建立一种根据拷贝数差异鉴别鲜、干金钱白花蛇的方法。4.提取自制金龙胶囊样品的DNA,采用高通量测序Illumina平台进行超深度测序,对线粒体基因组进行拼接注释,从而鉴定混合物中的动物成分。研究结果1.运用甲醇沉淀结合吸附柱的DNA提取方法,成功从金龙胶囊中提取出质量较高的DNA。2.设计出金钱白花蛇的特异引物Bmforw、Bmrev和探针Bmpro,建立的荧光定量PCR法线性关系良好、特异性好、灵敏度高、重复性好,并建议将102 copies/mg 的金钱白花蛇特异片段的拷贝数浓度作为检测标准之一。3.鲜、干金钱白花蛇间的拷贝数存在明显差异,建议将1.27×107 copies/mg的样品拷贝数浓度作为鲜、干金钱白花蛇的鉴别界限。4.根据高通量测序数据,拼接注释出了自制金龙胶囊中各动物组分的线粒体基因组,一步实现其中的多个动物成分的鉴定。结论本课题建立了一种适合金龙胶囊的DNA提取方法;基于qPCR法建立了一种金龙胶囊中金钱白花蛇组分的分子定量方法,可以为金龙胶囊的质量控制提供参考;建立了一种根据拷贝数鉴别鲜、干金钱白花蛇的方法,对鲜药制剂的质量控制有一定的借鉴意义;建立了一种不依赖于PCR的宏基因组分析技术对自制金龙胶囊中动物组分进行鉴别的方法,可为金龙胶囊中动物组分的分子鉴定提供参考。
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