结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染性疾病,多年来一直是全球公共卫生健康的巨大威胁。传统药物诸如异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺等曾在结核病的临床治疗中发挥巨大作用,但是随着多药耐药结核与广泛耐药结核的出现,以及结核与其他传染性疾病共感染病例的不断增加,人们希望发现效果更好的新型抗结核药物,能够改善现有治疗策略,降低联合用药风险。已有研究报道dUTPase参与结核分枝杆菌内的核苷酸生物合成途径,该酶通过将dUTP水解成为dUMP从而促进dTTP合成,为细菌DNA复制提供底物,同时能够稳定菌体内的dUTP/dTTP水平,避免DNA复制过程中出现大量的碱基错配,对于菌体存活和生长有着不可替代的作用。本研究中以结核分枝杆菌dUTPase（Mt-dUTPase）作为药物筛选靶标,首先利用大肠杆菌原核表达系统成功表达Mt-dUTPase蛋白,根据生物发光反应原理建立Mt-dUTPase抑制剂高通量筛选模型,对目标化合物库中的5000余种化合物进行了筛选。结合抗结核活性测定结果,得到一个对Mt-dUTPase蛋白具有较强抑制作用（IC50=0.80±0.09 μM）且抗结核活性明显的苯并咪唑类化合物F0414,其对结核分枝杆菌标准株H37Rv的MIC为4μg/mL。然后通过Discovery Studio分子对接软件分析F0414与Mt-dUTPase的结合方式,并根据对接结果进行了蛋白定点突变。酶活抑制反应结果显示F0414对关键氨基酸P79突变后的蛋白（Mt-P79A-dUTPase）抑制作用下降（IC50=2.28±0.55 μM）。SPR实验分析结果也显示F0414与Mt-P79A-dUTPase的结合作用有明显减弱,说明化合物F0414可能通过与Mt-dUTPase蛋白的P79结合后抑制其催化活性。本研究同时也发现F0414对人源dUTPase（h-dUTPase）的抑制作用较弱,二者亲和力较低,说明F0414能够选择性抑制结核分枝杆菌中的dUTPase活性,这可能是由于h-dUTPase氨基酸序列中缺失P79位点。体外细胞毒性实验表明,化合物F0414对哺乳动物细胞不存在明显毒性。本研究首次报道了化合物F0414对结核分枝杆菌dUTPase的抑制作用,该化合物具有较好的抗结核分枝杆菌活性且体外细胞毒性低,有望通过结构改造成为抗结核先导化合物,为发现新型作用机制的抗结核药物提供思路。