布鲁氏菌是引起人兽共患布鲁氏杆菌病的病原体,具有高度传染性。近几年布病疫情日趋上升,严重危害人类健康及我国经济发展,对于布病的防治工作已是当务之急。近年来,细胞表面分子的抗原靶向性治疗成为一种非常有发展前景的治疗方法。Cdc42是一个具有功能性的膜表面分子,本实验目标基因cdc42是从布鲁氏菌强毒株及S2疫苗株免疫雄性绵羊白细胞层抑制性差减杂交cDNA文库中筛选获得。Cdc42为Rho家族研究较多的一员,参与多项细胞活动,是细胞周期调控、细胞极性、肿瘤表达等方面中不可获缺的重要因子。克隆获得基因cdc42全长cDNA序列本实验从构建的绵羊SSH cDNA文库中筛选出了一批差异表达基因,并对相关差异表达基因进行了初步分析,经测序和NCBI BLAST同源搜索,筛选出疑似基因cdc42部分序列片段,片段长为176bp。应用RACE技术,设计两组特异性引物,进行3’RACE及5/RACE,扩增cdc42全长cDNA序列。经生物学软件DNAMAN和NCBI网站上的BLAST工具分析,获得全长cDNA序列,片段大小为1609bp,开放阅读框576bp,编码191个氨基酸残基,应用批量pI-Mw计算工具预测蛋白分子量约为21kDa,申请GenBank登录号为KC425615Ocdc42原核表达应用PCR方法,设计含有Nde Ⅰ与Xho Ⅰ酶切位点特异性引物,对完整编码区序列扩增,将扩增片段连接pMD18-T克隆载体,构建pMD18-TCdc42重组克隆载体。将测序正确的质粒双酶切后与pET30a表达载体进行连接,构建pET30a Cdc42重组表达载体。将构建的重组表达质粒经IPTG诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳,得到表达量为21kDa融合蛋白,菌体破碎,验证该蛋白主要以包涵体形式存在。制备抗Cdc42单克隆抗体将重组表达质粒进行大量诱导,切胶回收并纯化。将纯化后蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交骨髓瘤细胞,经过ELISA检测与克隆最终获得抗Cdc42单克隆抗体,经亚类试剂盒鉴定单抗为IgG类。通过Dot-blot与western-blot验证分析,制备的单克隆抗体与重组蛋白和天然蛋白发生特异性结合,说明制备出抗Cdc42单克隆抗体。