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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)作为一种猪病毒性传染病,其病原为PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)。目前PRRS在全世界的猪场广泛流行传播,造成了巨大的经济损失。2006年,我国突然爆发了猪高热病,其临床症状主要为持续高热,迅速死亡,传染性非常强,发病率接近100%,同时引起妊娠母猪严重流产等繁殖障碍,对我国养猪业产生了巨大危害,该病病原随后被鉴定为高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV,HP-PRRSV),该毒株是一种变异的PRRSV毒株。对于PRRSV的防控与净化目前还没有很好的方法,鉴于天然免疫在抗病毒过程中起着重要作用,因此需要进一步阐明其免疫机制,从而为该病的有效防控奠定基础。病毒感染宿主后,机体的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)会迅速识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信号通路从而诱导干扰素(interferon,IFN),以及下游干扰素诱导基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的大量产生,进而起到抗病毒作用。由于PRRSV具有免疫抑制的特性,之前的研究主要围绕在PRRSV蛋白对固有免疫的抑制效应及其机制,关于PRRSV如何被机体识别,以及诱导IFN产生的机制研究较少。本论文针对此问题进行了研究,取得的主要结果如下:1、本研究首先采用RNA结合蛋白免疫沉淀及测序(RNA-Binding Protein Immunoprecipitation sequence,RIP-seq)等实验方法分析了PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)过程中,PRRSV基因组被黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和视黄酸诱导基因I(RIG-I)识别的碱基序列,结果表明在PRRSV感染的PAM中,RIG-I和MDA5主要结合于PRRSV正链基因组的3’端非翻译区(3’untranslated regions,3’UTR),同时RIG-I和MDA5的结合有U/C和U/G碱基序列特异性。2、PRRSV属于套式病毒目,其基因组和亚基因组都含有共同的5’和3’UTR区域,对病毒的复制至关重要,同时本研究前期RIP-seq结果已证明,PRRSV 3’UTR区域对于免疫识别非常重要,因此我们进一步研究了PRRSV基因组5’和3’UTR与免疫识别之间的关系。结果表明,PRRSV基因组的5’和3’UTR能够刺激细胞产生IFN,并且位于PRRSV基因组3’UTR的假结结构能够作为一种新的PAMP被模式识别受体RIG-I和Toll样受体3(Toll like receptor 3,TLR3)识别,从而强烈地诱导IFN及ISGs的产生。由于假结结构是RNA病毒末端两个茎环相互作用形成的三级结构,能作为分子开关调节病毒RNA合成以及病毒复制,本研究发现此假结结构还能作为PAMP诱导抗病毒免疫应答,且将此假结结构相互作用破坏后其诱导IFN的能力显著降低。RNA-pull-down结果显示,RIG-I的调节区(regulation domain,RD)和TLR3的腔内区(ectodomain,ECD)均能与PRRSV基因组3’UTR的假结结构RNA结合。在PAM中转染此假结结构能显著抑制PRRSV复制,表明该结构具有抗病毒能力。序列比对及二级结构预测显示,动脉炎病毒科其它成员在基因组3’UTR都含有假结结构,此结构在动脉炎病毒科中非常保守,且这些病毒基因组的假结结构都能有效诱导IFN产生。3、对猪源RIG-I的RD区(pRIG-I-RD)进行了表达和纯化,并采用凝胶过滤层析验证了pRIG-I-RD和PRRSV基因组3’UTR假结结构RNA的相互作用。同时本实验采用小角散射(Small-angle X ray scattering,SAXS)技术分析了PRRSV 3’UTR假结结构RNA与pRIG-I-RD复合物在溶液中的状态,结果显示其为细长的大分子结构,可能含有多个区域,至少有两个中心。由于PRRSV基因组的5’末端带有帽子,其识别机制与之前报道的机制不同,因此本研究为深入研究RIG-I识别模式奠定了基础。综上所述,本研究鉴定了3’UTR的假结结构可以作为病原相关分子模式特异性激活RIG-I和TLR3介导抗病毒免疫应答,并且该模式在动脉炎病毒科中非常保守。结合以往研究,我们提出了一个PRRSV基因组3’UTR假结结构诱导IFN效应与PRRSV蛋白抑制IFN效应平衡的模型。在早期胞内体中,病毒基因组释放到细胞质内,基因组mRNA可以作为模板翻译复制转录酶蛋白(polyprotein precursors 1 a,pp1a)(polyprotein precursors 1 ab,pp1ab),经过切割后这些蛋白组装成复制转录复合体(replication and transcription complex,RTC),然后结合到PRRSV 3’UTR区域起始负链RNA合成。在PRRSV复制过程中,PRRSV基因组3’UTR假结结构能够被模式识别受体RIG-I的RD区和TLR3的ECD区识别并激活核转录因子κB(NF-κB)或干扰素调节因子3(IRF3)产生IFN。病毒的蛋白例如非结构蛋白1/2/4/11(nonstructural proteins 1/2/4/11,NSP1/2/4/11)和结构蛋白N蛋白可以通过靶向IRF3或NF-κB从而干扰宿主的抗病毒应答。因此,PRRSV基因组3’UTR假结结构既能作为分子开关调节病毒RNA合成,同时可以影响天然免疫识别以及下游IFN产生。本研究为探索PRRSV免疫识别机制及发现RIG-I和MDA5新的识别特征奠定了重要研究基础。