Sortase是存在于革兰氏阳性细菌中的一类生物转肽酶，在金黄色葡萄球菌中，Sortase A(SrtA)通过特异性地识别蛋白底物C末端保守序列LPXTG（X代表任意氨基酸），断裂苏氨酸和甘氨酸之间的肽键，形成酶和底物的硫酯中间产物，然后在N端为甘氨酸的亲核蛋白底物的攻击下，取代SrtA，通过形成肽键实现两个蛋白之间的共价连接，将蛋白展示在细胞表面。鉴于SrtA的特异性以及反应条件的温和性，进一步分析其底物谱，扩大其应用范围具有重要意义。本论文主要包含三部分:　　第一部分，发明了一种高通量分析SrtA底物谱的方法。我们构建了针对SrtA7M（较天然SrtA有7个氨基酸突变的高活性SrtA突变体）识别序列LPATG的底物文库(XXAXG)，发明了一种以酶介导的蛋白片段互补技术为基础的简单、快速、高通量、高灵敏性的多肽连接酶底物谱分析方法。利用此方法，不仅发现了已知的所有不同活性的SrtA7M底物，而且还发现了一系列具有不同活性的全新底物，证明了此分析系统的可行性，提供了一种简单、快速、高灵敏、高通量的底物筛选方法。　　第二部分，设计发明了一种新型的酶进化系统。利用SrtA转肽酶，通过整合酵母表面展示技术，酶介导的生物连接技术以及荧光激活细胞分选技术，我们建立了一种多肽/蛋白连接酶体外定向进化的系统。利用此系统，我们成功筛选到了具有极高生物活性的连接酶SrtA7M，初步验证了这套系统的可行性。　　第三部分，利用SrtA7M对多种T细胞进行了表面标记、修饰。借助SrtA7M广谱的底物识别序列，实现了对多种T细胞表面蛋白的体外标记，并且尝试通过LC-MS分析被标记的表面蛋白。　　通过本论文的研究，我们对SrtA7M的识别底物有了更加彻底的认识，对酶活性和底物识别序列特异性有了整体性的把握。显而易见，掌握转肽连接反应的最佳底物识别序列以及最优亲核底物等信息，对更加有效地将SrtA7M应用在生物连接等方面至关重要。在本论文中，我们不仅发明了一种新的方法，实现了针对SrtA7M的高通量底物谱分析，发现了一些新型的SrtA7M转肽酶识别底物，还进一步建立了一种新型的酶进化体系用于转肽酶的进化。在此基础上，将SrtA7M应用在T细胞的体外修饰，具有一定的临床应用价值。