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随着航天技术的高速发展,各个国家开展了许多关于将实验动物送入太空的项目,在项目的实施过程中获得了一些难以在地面进行重复的实验数据,这些数据可以当作模拟微重力环境的对照,与地面上空白对照的数据进行比较。小鼠是实验室生物学研究中用到的主要实验材料。然而,目前针对微重力影响下小鼠前庭系统基因表达的研究比较少。虽然已经发现在空间中下橄榄核和内侧前庭核的活性会被显著激活,但是对微重力环境下这些结构的神经可塑性的分子机制几乎一无所知。在微重力前庭刺激期间,对这些组织结构的细胞进行大规模全基因组检测来筛选被激活的基因是很重要的。因此,本研究的目的主要是研究在BION-M1卫星上进行30天太空飞行的小鼠大脑内前庭核和下橄榄核基因表达谱的变化,并将该基因表达谱与后肢卸载模型模拟微重力的小鼠的数据进行比较。这些发现将使我们能够建立一个关于前庭感觉系统不同水平神经元可塑性相关分子机制的假设,并且这些假设将是有充分根据的。2013年4月,为实施俄罗斯联邦国家科学中心、俄罗斯科学院生物医学问题研究所以及俄罗斯科学院高级神经活动与神经生理研究所的联合项目,将搭载4个月大的雄性C57BL6实验小鼠的BION-M1航天器发射到近地轨道。2013年5月19日至6月20日,经过30天的飞行后,小鼠成功返回地球,将小鼠采用颈椎脱臼的方法处死,置于冰上,立即将前庭核区(菱形窝底部的脑干背侧部分)、下橄榄区(脑干腹侧部分)与活体脑分离。此外,还收集了在生物卫星上航天飞行30天后返回地球的动物标本,共制备了8个对照样品以及12个空间样品。分离得到大脑结构后,立即将部分样品放入RIP A裂解缓冲液中提取分离总RNA。cDNA文库的构建于2013年5月进行,根据True Seq协议进行。在Illumina Hi Seq2500平台上通过RNA-Seq进行全基因组基因表达分析(与上海CAS-MPG计算生物学研究所Philip Khaitovich教授合作)。对样本中基因表达的全基因组分析让我们能够获得14个小鼠(空间样品8个)大脑结构的转录组。为了进行进一步分析,使用了7个VE转录组(4个空间组,3个对照组)和6个IO转录组(4个空间组,2个对照组)。2020年10月,使用不同的生物信息学方法分析了这些数据。使用STAR程序将获得的读数与小鼠基因组(Gene Cod v.27版本)相关联。IO每个样本的平均read数为2 000万,VE为1 500万,其中对齐后的唯一read数约为90%。使用DESeq2(差异表达分析)和ggplot2(可视化)库在R语言中进行统计分析。实验还应用了PCA和MCR方法。对具有差异表达基因的基因本体术语进行了丰富度分析(使用Metascape服务)。此外,样本在结构内分为两组。但是由于样本量不足,无法单独分析这些组,无法显示结果存在显著差异,但是结果存在不同,这是本研究课题进一步发展的相关方向。本研究通过创建一个组比较来自空间和对照样本的结构中基因表达的差异,并将橄榄核和前庭核的基因表达谱与脑基因的基本表达进行比较。在微重力作用下,由于生理压力梯度消失,动脉血管系统受到损伤,从而发生血流的再分配。与正常重力条件下观察到的结果相比,微重力下,身体上部的血管会承受更高的血压,而在微重力条件下,供给身体下部的血液比较少。研究中常用到的后肢卸载模拟微重力的模型就是根据血液头向分布设计的。本实验采用10只4个月大的雄性C57BL6小鼠,随机分为四只对照组、六只实验组。利用后肢卸载模型模拟微重力,将大鼠的尾巴悬挂,使大鼠身体与地面呈现45°角,前肢着地,以模拟太空飞行过程中发生的血液流向。将每只老鼠都分配到一个单独的笼子里,可以自由获取食物和水。每三天清洁一次笼子。所有动物程序均按照“俄罗斯国家生物伦理委员会生理学系的规则”进行。这些数据可以得出说明该模型在微重力模拟中的适用性以及前庭结构激活的结果相似性。但是由于模型样本总cDNA文库的构建和测序需要大量的时间和财务成本,因此这些样本的生物信息学分析将在学生毕业后在俄罗斯科学院高等神经活动与神经生理学研究所的支持下进行。在本研究中,仅使用液滴数字聚合酶链反应(dd PCR)来测试这种广泛使用的模型的相关性,并将结果与真实太空飞行中获得的生物信息学结果相比较。该方法基于聚合酶链反应微流控技术,是传统rt-PCR的改进技术,可直接计算核酸标签数量。与众所周知的定量PCR不同,数字PCR是一种绝对测量方法。目标DNA的浓度在初始样品中确定为一系列以微升为单位的拷贝,灵敏度高达1个分子。对于每个反应,总cDNA底物输入为10.1或1 ng/μl,反应混合物中引物的终浓度为0.09μM。我们选择以下基因通过dd PCR方法测试表达水平:IO:MMRN2,Igf2,MPZ,Unc13a,AHNAK,Tgfb1,Tgfbr3,NOS3,Wnt4,Junb,MEG3,Plxnb3;VE:ERC1,Pou3f2,ND1,Cytb,COX1,PLVAP。使用“RStudio”程序(版本1.4.1106,RStudio,PBC)和“Past”(V.4.03)分析从dd PCR获得的数据。在样本量有限的情况下,使用非参数方法(Mann-Whitney)分析。还基于基因表达计算所有样品的平均值±SEM。本研究获得了以下结果:C57BL6小鼠在BION-M1卫星上进行30天的太空飞行后,在其下橄榄核中观察到与血管生成、生长因子和细胞外基质变化相关的差异表达基因增加。表明与分解代谢过程和mRNA加工的负调节相关的基因表达减少。C57BL6小鼠在BION-M1卫星上进行30天的太空飞行后,在其内侧前庭核中观察到与线粒体反应相关的差异表达基因增加。表明与脂质代谢、细胞内转运和神经递质转运相关的基因表达降低。C57BL6小鼠在BION-M1卫星上进行30天的太空飞行后,通过橄榄核中的液滴数字聚合酶链反应方法证实基因MPZ,MEG3,Plxnb3,Unc13a和Junb的表达具有差异。Plxnb3,Unc13a和Junb使用测序数据通过生物信息学分析获得的结果基因揭示了表达谱的变化,C57BL6小鼠在BION-M1卫星上进行30天的太空飞行后,通过液滴数字聚合酶链反应方法证实了PLVAP,Pou3f2,ERC1,ND1和COX1基因在C57BL6小鼠内侧前庭核中的表达具有差异。PLVAP,ND1和COX1基因的表达谱变化与使用测序数据通过生物信息学分析获得的结果相似。基于后肢卸载模型的模拟微重力实验表明,在后肢卸荷模型条件下,获得的结果与太空飞行组PLVAP和ND1基因相关的内侧前庭核中基因表达谱的变化相同。对于Junb,Plxnb3,Unc13,COX1基因,观察到基因表达谱变化有着相反的趋势。因此,根据获得的数据可以得出结论,在真实的太空飞行中,随着来自神经系统的传入刺激显著减少,C57BL6小鼠的内侧前庭核和橄榄核下部的基因表达谱发生了变化。主要的变化与细胞的血管化和线粒体反应有关,而研究结构的功能负荷降低,这与分解代谢调节的抑制、mRNA加工的减慢和细胞内转运的中断有关。所得结果与已知文献数据一致。在所研究的BE区域的前庭结构中,观察到与神经递质转运相关的基因的功能负荷减少。该信息是独一无二的,并且此类变化可能与由于来自上肢和下肢的传入刺激以及身体重新定位到更可靠的身体位置视觉控制系统而导致的前庭系统负荷减少有关。经过30天的太空飞行,MPZ基因在IO区域的生物信息学分析中经常表现出最显著的成倍数的变化,获得的数据与已知的文献数据相矛盾。结果表明,在微重力模型条件下,该基因在中枢神经系统中的表达显著降低,但不是在前庭结构中,而是在小鼠和大鼠脊髓的腰椎增厚中。因此,真实太空飞行实际上只能增加该基因在橄榄核下部的表达,而降低其在神经系统其他部位的表达。因此,该基因需要进一步的研究,并且与小鼠大脑前庭结构中的表达有关。此外,值得使用免疫组织化学进一步分析该基因在橄榄脊髓束投射中的表达。在单个基因的表达水平上,表明广泛使用的后肢卸荷模拟微重力模型与小鼠大脑前庭结构神经可塑性反应和过程中PLVAP和ND1基因的表达有关。由于样本的独特性以及数量有限,这项工作对于在航天飞行和微重力建模条件下进一步研究和鉴定相似的差异表达基因仍然具有重要意义。这项工作得到了俄罗斯科学院高级神经活动和神经生理学研究所的支持。特别感谢来自俄罗斯P.Balaban和P.Kolosov的项目科学负责人。