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研究背景与目的缺血性心脏病严重威胁人类生命健康,心肌梗死发作时有十亿级的心肌细胞发生死亡,之后死亡的心肌组织被疤痕所代替,缺乏正常的心肌收缩舒张功能,严重影响患者生活质量。近年来,干细胞移植成为新方法之一,其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有分化成心肌细胞的能力,可以替代缺血坏死的心肌细胞。尽管移植的MSC对心肌有保护作用,但研究发现移植的MSC难以存活,且极为少数的MSC会向心肌细胞分化,因此MSC对心肌的保护是间接的。MSC表面表达CD73,CD90和CD105。其中CD73又称之为外膜5-核苷酸酶(ecto-5-nucleoditase,NT5E),其功能是细胞外催化一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)生成腺苷,而腺苷可以作用于细胞上的腺苷受体(adosine receptors,ARs),分为A1,A2A,A2B和A3型腺苷受体四种(A1R,A2AR,A2BR和A3R)。MSC可以通过免疫调控,作用于免疫细胞以达到对心肌的保护。其中激活的T细胞高表达A2AR和A2BR,而已经有研究证实激活CD4+T细胞上的A2AR可以诱导其向T调节细胞(T regulatory cells,Tregs)分化,Tregs具有免疫抑制和组织保护的作用。然而T细胞上A2BR的激活是否能够诱导Tregs,以及T细胞上A2BR在干细胞治疗中的作用还有待阐明。本课题通过假设“干细胞CD73→腺苷→T细胞上A2BRs→免疫抑制→心肌保护”以验证干细胞所产生的腺苷是否通过调控T细胞表面A2BRs,产生抗炎效应,从而为心肌再生提供有利条件。通过进一步研究MSC对T细胞的作用,从而阐明MSC在心肌缺血中的免疫调控机制,为指导治疗提供更多新的理论证据。实验对象及方法一、探索MSC表面CD73的功能1.将大鼠分为假手术组、心梗组和心梗+干细胞移植组,5天后取出心脏将其悬挂在蓝格多夫(Langendorff)装置上,使用Krebs缓冲液进行灌注使心脏跳动,采用“倒挂心脏法”收集心脏渗出液,通过高压液相层析(high pressure/performance liquid chromatography,HPLC)检测其腺苷浓度。2.选野生型C57BL/6小鼠(下同,转基因小鼠会特别说明)和CD73-/-小鼠两组,提取其脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)。体外培养并扩增后,第一部分细胞行流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测CD73的表达;第二部分细胞行实时荧光定量PCR(quantitative PCR,q PCR)检测腺苷生成分子CD39和CD73,以及其他细胞因子的表达;第三部分继续培养为后续共培养实验做准备。二、探索CD73+MSC对T细胞的调控作用1.选野生型小鼠,分离其淋巴细胞,并用抗CD3和CD28抗体共同刺激3天,再行CD4+T细胞的磁珠分选。分选后的CD4+T细胞与ADMSC(野生型和CD73-/-小鼠)共培养24小时,之后使用q PCR检测T细胞相关分子。2.由于FCM发现小鼠ADMSC所表达的CD73不如人脐带血间充质干细胞(human umbilical vein mesenchymal stem cells,h UVMSC,之后简称MSC),故之后的实验使用该细胞进行实验。按照上述方法分选后CD4+T细胞后与MSC共培养24小时,分选后先行CFSE染色(增殖指标),之后用q PCR测T细胞相关分子,bioplex检测上清干扰素γ(interferon-gamma,IFN-γ),FCM测抗炎分子CD39和CD73,并检测增殖状态。3.根据上述实验发现了MSC可以促进T细胞向Tregs分化,故将na?ve CD4+T细胞激活后,马上与MSC共培养72小时,之后用FCM测转录因子FOXP3的水平。三、探索凋亡CD73+MSC对T细胞的调控作用1.干细胞移植入梗死心肌后会逐渐凋亡,为了尽可能模拟干细胞在体内的真实状态,使用星形孢菌素诱导MSC凋亡,并行凋亡染色。之后对正常/凋亡的干细胞行CD73的流式检测,以证实凋亡干细胞是否可能生成更多腺苷。2.按照上述方法行CD4+T细胞分选,分选后先行CFSE染色,再与凋亡的MSC共培养24小时,之后用q PCR测T细胞相关分子,FCM测抗炎分子CD39和CD73,并检测其增殖状态。3.同第二部分,将na?ve CD4+T细胞激活后,马上与凋亡的MSC共培养72小时,之后用FCM测转录因子FOXP3的水平。四、探索CD73下游A2B腺苷受体在调控T细胞过程中的作用1.选野生型小鼠和A2BR-/-小鼠两组,行CD4+T细胞分选,分选后与正常和凋亡MSC共培养24小时,之后行q PCR检测T细胞相关分子,FCM检测T细胞抗炎分子CD39。为了更一步证实A2BR的作用,部分实验在培养T细胞前对其使用A2BR拮抗剂。2.类似,将na?ve CD4+T细胞激活后,首先使用A2BR拮抗剂,再马上与正常和凋亡的MSC共培养72小时,之后用FCM测转录因子FOXP3的水平。结果一、MSC表面CD73的功能分析在心肌灌注中,CD73+MSC处理过的心脏渗出液中含有更多的腺苷。体外培养中,CD73-/-MSC表达更低水平的腺苷生成酶(CD39和CD73)。二、CD73+MSC对T细胞调控的分析CD73+MSC对T细胞有免疫抑制作用,CD73缺失后该作用也会消失。MSC与T细胞在长时间的共培养后,MSC可以诱导T细胞向Tregs分化。三、凋亡CD73+MSC对T细胞调控的分析凋亡的MSC其表面表达更多CD73,可能生成更多细胞外腺苷,对T细胞的免疫抑制更强。但凋亡MSC与T细胞在长时间的共培养后,凋亡MSC不能诱导T细胞向Tregs分化,所产生的免疫抑制效应主要是由于凋亡的MSC总体抑制了T细胞增殖水平。四、CD73下游A2B腺苷受体在调控T细胞过程中的作用CD4+T细胞上的A2BR参与了正常或凋亡MSC对T细胞的免疫抑制,也参与了T细胞向Tregs的分化过程。结论CD73+MSC移植于梗死心肌后,灌注的心脏能渗出更多腺苷;MSC上的CD73能维持稳定的抗炎环境,为心肌修复提供有利条件。CD73+MSC所产生的细胞外腺苷能抑制T细胞的免疫状态,长时间的腺苷刺激可以T细胞向Tregs分化。凋亡的CD73+MSC细胞外有更多腺苷,所产生的免疫抑制作用更强,但其对T细胞的免疫抑制方式主要是抑制了T细胞的总体水平。A2BR参与了正常或凋亡MSC所介导的抗炎效应,并参与了Tregs的分化过程。