钠尿肽(natriuretic peptides，NPs)是一组具有利钠、利尿、舒血管和抗细胞增殖效应的多肽，近年来NPs对心力衰竭、心肌肥厚和移植血管再狭窄等的负调控作用及其临床应用前景受到广泛关注。并且，实验发现心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和C-型钠尿肽(c-type natriuretic peptide，CNP)对大鼠心肌有负性变力作用，而ANP抗心律失常的实验研究也有报道，ANP可遏止心肌缺血伴发的心室颤动。其中血管钠肽(vasonatrin peptide，VNP)是人工设计、合成的钠尿肽家族新成员，研究表明VNP可以有效地防治大鼠低氧性肺动脉高压和右心室肥厚，除了这些作用外，是否对心肌细胞的收缩功能和兴奋收缩偶联过程有调节作用，目前尚不清楚。离子通道与细胞的电生理学表现和细胞的收缩都有重要的作用，因此，VNP是否对心肌细胞的离子通道有调节作用也值得我们进一步研究。 钠尿肽抗肾上腺素的功能表现为降低Iso介导的心室收缩力增强与心肌细胞缩短、内向的钙电流与动作电位时程与幅度及细胞内与收缩功能有关的各种蛋白磷酸化。 研究认为在心室肌细胞的兴奋——收缩偶联需要细胞钙瞬变幅度升高。电压敏感的钙电流启动了钙瞬变，使细胞内钙浓度升高，导致了肌浆网钙释放。细胞钙瞬变的增高导致细胞的收缩。Iso激活-肾上腺素受体显著增强心肌的收缩能力，至少部分是通过布四门民医大月卜节阵士学心比侧仑文增加流过钙通道的钙电流[4l及升高心室肌细胞钙瞬变幅度和缩短其时程实现的15.61。通过150激活腺昔酸环化酶产生这些效应，使依赖cAMP的钙通道蛋白激酶l7]和与收缩有关的蛋白磷酸化[8]。 本工作研究了VNP对大鼠心肌细胞收缩幅度和钙瞬变幅度、L型钙电流以及钠电流的影响和相应的机制。 1.目的 (l)探讨vNP对Is。刺激的大鼠心肌细胞钙瞬变和收缩幅度的影响，进一步阐明VNP调节心肌细胞收缩的细胞内信号转导通路。 (2)探讨vNP对L型钙电流、钠电流的影响，及VNP作用于细胞后的细胞内信号转导分子对离子电流的影响，旨在扩展VNP的研究和应用领域。 (3)由于肾上腺素有引起和促进许多心血管疾病的作用，因此，对抗它的作用可以为临床防治某些心血管疾病提供可能。钠尿肤家族有这方面的特性，研究VNP的作用，为下一步的整体实验提供细胞学基础，为进一步应用于临床提供可能。 2.方法 (l)以常规酶解法分离成年大鼠心室肌细胞后逐步复钙，得到分离的钙耐受心室肌细胞。 (2)心室肌细胞收缩采用IonOPtix单细胞动缘探测系统同步检测心肌细胞的收缩及钙瞬变，观察VNP对150刺激的心肌细胞钙瞬变及收缩幅度的影响，以及8一Br一cGMP、HS一142一1和美蓝(methylene blue，MB)对这一过程的影响。研究vNP对150刺激的心肌细胞收缩及钙瞬变的影响及可能的细胞内信号转导通路。 (3)心室肌细胞收缩采用IonOPtix单细胞动缘探测系统同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变，观察VNP对150刺激的心肌细胞收缩及钙瞬变的影响，cholera toxin和forskolin对这一过程的影响，以及VNP对Is。刺激的细胞内cAMP以含量的影响。研究VNP对150刺激的心肌细胞收缩及钙瞬变幅度的影响，及VNP作用于150的细胞内信号转导通路的可能部位。 (4)采用全细胞膜片钳技术，观察vNp对L型钙电流的作用，一5—月夕r认2004常四早医大学俘d卜举位伦文以及8一Br一cGMP、HS一1 42一1和MB对这一过程的影响。研究VNP对L型钙电流的影响及细胞内作用机制。 (5)采用全细胞膜片钳技术观察VNP对钠电流的作用，以及8一Br一GMP、HS一142一1和MB对这一过程的影响。研究VNP对钠电流的影响及可能的机制。 3.结果 (l)10一’0~1护mo比的150使电刺激引起的单个心肌细胞钙瞬变及收缩幅度呈剂量依赖性增加，此效应可被肾上腺素受体阻断剂-—普蔡洛尔(10石m。比)所阻断。 (2)10一10一10石m。比的vNp可剂量依赖性减弱150升高的细胞内钙瞬变和收缩幅度。vNp的这一效应可以由8一B卜cGMP(10一7一10一3 mol几)模拟，被Hs一142一l(Zxlo一，mo比)或MB(10一5 mol几)完全阻断。 (3)Is。使心肌细胞内的cAMP水平显著升高。而150升高的心肌细胞内cAMp含量可被10一mol几的vNP显著降低，此效应可被 Zx一0一smo比的HS一142一l所阻断。 (4)Gs蛋白的激动剂cTx和10一7一5 x 10一，mo比的腺昔酸环化酶(AC)激动剂forskolin，可使电刺激引起的单个心肌细胞钙瞬变和收缩幅度增加。用10石m。比的vNp可显著抑制此效应。 (5)vNP显著抑制150刺激的心肌细胞Ic。.L。vNp的这一效应可以由8一Br一eGMP模拟，而被HS一1 42一l(2/10一smo比)或MB (10一moljL)完全阻断。 (6)VNP显著抑制心肌细胞玩。。VNP的这一效应可以由s一Br-C GMp模拟，而被HS一142一1(Zx 10一smoljL)或MB(10一smo比)完全阻断。 4.结论 (1)vNp降低150兴奋引起心肌收缩力的增强，至少部分是通过激活GC偶联的钠尿肤受体，刺激cGMP生成，导致细胞内钙瞬变幅度降低而发挥作用的。说明VNP的作用是通过激活其特异性受体来实现的。一6一助成2口04布四闰?