红景天为景天科红景天属多年生草本植物,或亚灌木野生植物,其种类繁多,是具有悠久历史的珍贵传统药材,入药主要部位是干燥根或根茎。红景天的药理作用主要有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老、抗辐射和抗病毒等,已作为具有明显抗缺氧作用的中药而广泛应用于临床。红景天的化学成分复杂,主要包括酚苷类、黄酮类、香豆素类和氨基酸类等,其中酚苷类的红景天苷和黄酮类成分中的红景天素和草质素苷是主要活性成分。在定量测定和药代动力学研究方面,红景天苷作为红景天的主要成分研究得最多,红景天素和草质素苷也有一些研究,测定方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色谱质谱联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法和超高效液相色谱质谱联用(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法等。但采用UPLC-MS/MS同时测定血浆中的红景天苷、红景天素和草质素苷及其药动学未见报道,缺氧条件下其活性主成分的药代动力学更未见报道。本研究首先应用UPLC-MS/MS建立了红景天6个活性成分红景天苷和黄酮类化合物(红景天素、草质素苷、草质素、槲皮素、山柰酚)的定量测定方法,为后续红景天活性成分的药代动力学和抗缺氧的研究奠定基础。接着选取红景天主要活性成分红景天苷、红景天素和草质素苷作为受试药,建立了同步测定这三种成分的体内UPLC-MS/MS定量方法,比较研究了在缺氧和常氧条件下这三种成分的药代动力学特征。结果为红景天活性成分的结构和新制剂改进及低氧临床用药提供了坚实的实验依据。本论文的研究内容主要包括以下几个部分:1.红景天主要活性成分的含量测定建立了快速、灵敏度高和专属性好的UPLC-MS/MS的方法,对红景天提取物中的标示成分酚苷类成分(红景天苷)和黄酮类成分(红景天素、草质素苷、草质素、槲皮素和山柰酚)进行了含量测定。液相条件:流动相为乙腈和0.2%甲酸水,梯度洗脱,流速为0.4 ml/min,分析过程7 min。质谱条件:电喷雾离子化源(electrospray ionization,ESI),多重反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)定量扫描。离子反应分别为:m/z 345.0→299.0(红景天苷)、m/z 609.1→301.0(红景天素)、m/z 447.1→301.0(草质素苷)、m/z 301.0→254.8(草质素)、m/z 284.8→92.9(山柰酚)和m/z 301.1→151.1(槲皮素)。验证了方法学的精密度、稳定性、重复性和加样回收率,均符合测定要求。对三个批次的红景天提取物进行了测定。结果表明,红景天苷的含量最高,为1.11%。黄酮类化合物中红景天素和草质素苷的含量比较高,分别为0.41%和0.32%。由于红景天苷、红景天素和草质素苷的含量相对较高,且具有明显的药理活性,因此,选择这三种成分进行药动学特征研究。2.红景天苷、红景天素和草质素苷体内分析方法的建立与验证首次建立了同时测定红景天苷、红景天素和草质素苷的UPLC-MS/MS大鼠血浆药物浓度测定方法。选用葛根素为内标,反应离子:m/z 417.3→297.1。结果表明,三种成分和内标的峰型和分离度良好,且内源性物质不干扰测定。血浆中红景天苷的线性范围为5-2500 ng/ml,红景天素为10-2000 ng/ml,草质素苷10-1000 ng/ml。定量下限(lower limit of qualification,LLOQ)分别为5ng/ml,10 ng/ml及10 ng/ml。三种成分的低、中、高3个浓度的质控(quality control,QC)样品的提取回收率在63.8-98.6%之间。红景天苷的日内与日间精密度小于10.4%,准确度在91.8-100.0%之间。红景天素的日内与日间精密度小于8.05%,准确度在89.5-97.6%之间。草质素苷的日内与日间精密度小于8.69%,准确度在83.8-87.8%之间。选择三个条件(进样器存在4 h,-20℃冷冻-溶解三次,-80℃存放7天)进行稳定性验证,红景天苷、红景天素和草质素苷的准确度范围分别为88.3–109%,76.6–99.6%和75.6–98.6%。黄酮苷类化合物红景天素和草质素苷的提取回收率比红景天苷要低。酸化可提高黄酮苷类在血浆样品中的稳定性。3.低氧对红景天苷、红景天素和草质素苷药代动力学特征的影响20只Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为四组,即常氧口服组,常氧静脉组,缺氧口服组和缺氧静脉组,每组5只。常氧组大鼠暴露于常氧条件下,缺氧组大鼠在低氧舱内暴露3d后给药,低氧舱内氧气浓度控制在(9.0±0.5)%。红景天提取物的给药剂量为,口服组400 mg/kg(其中:红景天苷4.44 mg/kg,红景天素1.64 mg/kg,草质素苷1.28 mg/kg),静脉组40 mg/kg(其中红景天苷0.444 mg/kg,红景天素0.164 mg/kg,草质素苷0.128 mg/kg)。UPLC-MS/MS测定血浆药物浓度。采用DAS软件计算主要药代动力学参数,采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析处理。结果表明,在缺氧条件下,红景天苷、红景天素和草质素苷的药代动力学特征发生显著变化。缺氧暴露后,红景天苷的药-时曲线下面积(area under the curve,AUC)明显升高(p<0.05),平均驻留时间(mean retention time,MRT)和半衰期(half life,t1/2)明显延长(p<0.001和p<0.05),表明缺氧导致红景天苷的体存量增加,体内存留时间延长,药物消除变慢。其达峰浓度(maximum concentration,Cmax)和达峰时间(time of peak concentration,tmax)没有发生显著性变化,提示其吸收过程相似。常氧条件下,口服后所测得的红景天素和草质素苷的药物浓度低于定量下限(可能是由于自己所建方法的定量下限过高),但在缺氧条件下能得到各自较完整的药-时曲线。缺氧静脉给药后,红景天苷、红景天素和草质素苷的AUC都显著升高(p<0.05),其清除率(clearance,CL)均明显变小(p<0.05)。此外,红景天素的MRT和t1/2都明显延长(p<0.01),草质素苷的t1/2也延长(p<0.05),提示缺氧可以增加红景天苷、红景天素和草质素苷的体存量,延长体内存留时间,使消除减慢。总之,缺氧可以影响红景天苷、红景天素和草质素苷在大鼠体内的代谢动力学过程,进而影响药物的治疗结果和毒性。临床给药需要相应调整剂量。4.红景天提取物口服(5倍剂量)常氧条件下的药代动力学研究研究常氧条件下口服给红景天提取物后,红景天素和草质素苷在大鼠血浆中未检测到的原因。将红景天提取物口服剂量提高5倍,用UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中红景天苷、红景天素和草质素苷含量。结果表明,给药剂量提高5倍后,红景天苷显示出双峰的药-时曲线,推测可能存在肝肠循环。红景天素和草质素苷也能可得到较完整的药-时曲线,但Cmax的水平都较低,体内暴露量较低,生物利用度分别只有0.98%和1.47%。红景天素和草质素苷较低的生物利用度导致在给药剂量较低的情况下进入血液循环的药物量更少,低于定量限而不能检测到原型药物。本研究为红景天提取物及其主要成分红景天苷、红景天素和草质素苷在低氧环境下的给药方案的调整和优化提供了坚实的实验依据。