心肌梗死（myocardial infarction,MI）等缺血性心脏病导致的心力衰竭是一种严重危害人类健康的心脏疾病。传统治疗方法主要包括药物治疗、溶栓疗法、经皮冠状动脉介入治疗以及冠状动脉旁路移植术等。近年来,研究发现干细胞移植可保护梗死局部的心肌细胞,并促进血管新生,进而改善心功能,成为很有发展潜力的治疗手段之一,其中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是心血管领域干细胞移植的常用类型。虽然,BMSC移植可以在一定程度上改善心功能,但在梗死区缺血缺氧微环境中会出现存活率低、细胞活性差及细胞衰老等问题,严重降低了疗效。因此,有必要寻找相关解决方法。国内外研究发现,应用基因修饰预处理干细胞可以起到一定的作用。整合素连接激酶（integrin linked kinase,ILK）是一种高度表达在心血管系统的丝/苏氨酸蛋白激酶,参与了心脏多种功能,如心肌收缩,代偿性肥大,心肌存活、促进血管新生以及控制内皮祖细胞向缺血组织迁移等等。我们前期的实验也证实ILK修饰的c-kit+干细胞能够改善心梗后的心功能,因此我们认为进一步研究ILK对BMSC的影响,以及ILK修饰的BMSC对心肌细胞功能的影响及分子机制,并确定ILK作用的活性位点,可以阐明ILK基因修饰BMSC的作用原理及修饰后BMSC调控心肌细胞功能的相关机制,为提高干细胞移植改善心梗后心功能的疗效提供更有效的方法和手段。目的:明确不同活性的ILK对BMSC存活、增殖、迁移和凋亡的影响,进一步探讨ILK过表达的BMSC对心肌细胞H9c2凋亡的作用及相关分子机制,并确定ILK作用的活性位点。方法:1.构建含不同活性ILK的慢病毒表达载体,并感染BMSC构建含野生型ILK（WT-ILK）、无激酶活性ILK（ILK-S343A）、高激酶活性ILK（ILK-S343D）、显性突变ILK（ILK-E359K）慢病毒表达载体,分别感染BMSC。通过观察GFP荧光及应用Western blotting（WB）检测细胞中ILK蛋白表达鉴定感染效率,并应用嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,获得稳定感染的BMSC。将BMSC分为对照组（control）、空载体组（null）、WT-ILK组、ILK-E359K组、ILK-S343A组和ILK-S343D组。2.ILK对BMSC存活、增殖、迁移和凋亡的影响用活细胞计数和CCK8（cell counting kit-8）试剂盒检测各组BMSC存活和增殖,并通过WB检测增殖相关基因PCNA和Cyclin D1;用划痕实验和Transwell跨膜迁移实验检测各组BMSC的迁移;用DAPI染色、TUNEL染色鉴定过氧化氢（H2O2）诱导的各组细胞的凋亡,并通过WB观察凋亡相关基因Caspase3的蛋白表达。3.ILK高表达的BMSC对心肌细胞凋亡的影响将各组BMSC与心肌细胞（H9c2）进行非接触性共培养,通过DA PI和TUNEL法检测H9c2凋亡。分别提取null组、WT-ILK组、ILK-S343A组和ILK-S343D组BMSC中的外泌体,并进行鉴定。将以上各组外泌体与H9c2共培养后,用上述方法检测心肌细胞凋亡,并检测Caspase3蛋白表达。结果:1.成功构建表达WT-ILK、ILK-E359K、ILK-S343A和ILK-S343D的慢病毒载体,并在BMSC中获得稳定表达。2.过表达ILK调节了BMSC的存活和增殖细胞计数和CCK8实验结果均表明,与control和null组比较WT-ILK组和ILK-S343D组细胞存活和增殖明显增加,而且后者增加更明显,ILK-S343D组细胞分别是WT-ILK组细胞的（1.58±0.39）倍（P<0.05）和（1.60±0.03）倍（P<0.01）。于此不同,ILK-E359K组和ILK-S343A组活细胞数下降。进而,WB结果表明,ILK-S343D组细胞中增殖相关基因PCNA和Cyclin D1的表达均高于WT-ILK组,说明过表达ILK调节了BSMC的存活和增殖,且与其343位点的激酶活性以及359位点的功能有关。3.过表达ILK调节了BMSC的平面和跨膜迁移划痕实验和Transwell跨膜迁移实验结果表明,WT-ILK组和ILK-S343D组细胞的迁移明显增加,WT-ILK组相对剩余面积是null组的（0.64±0.06）倍（P<0.05）,跨膜迁移细胞数是null组的（1.67±0.03）倍（P<0.05）,且ILK-S343D组是WT-ILK组的（0.64±0.03）倍（相对剩余面积）（P<0.05）和（1.32±0.05）倍（跨膜迁移细胞数）（P<0.05）,而ILK-E359K组和ILK-S343A组细胞迁移能力降低,说明ILK过表达调节了BMSC的迁移,这种作用与其343和359位点的活性相关。4.过表达ILK调节了BMSC的凋亡DAPI和TUNEL实验获得相似的结果,均表现为与null组比较,WT-ILK组和ILK-S343D组细胞的凋亡下降,且ILK-S343D组的更明显,而ILK-E359K组和ILK-S343A组凋亡的细胞略增加,Caspase3蛋白表达与以上各组趋势一致,说明ILK通过激酶活性调节了BMSC的凋亡。5.ILK高表达的BMSC通过外泌体途径影响心肌细胞凋亡将各组BMSC与H9c2共培养后,检测心肌细胞的凋亡,DAPI和TUNEL实验结果表明,与WT-ILK组和ILK-S343D组BMSC共培养的H9c2凋亡减少,且ILK-S343D组是WT-ILK组的（60.23±0.12）%（P<0.05）和（65.45±1.02）%（P<0.05）。在外泌体共培养实验中,我们证实了来源于ILK-S343D组BMSC的外泌体（SD-BSMC-Exos）比空载体组（Null-BMSC-Exos）和野生型组（WT-BMSC-Exos）能更有效的抵抗H2O2诱导的心肌凋亡,并且Caspase3蛋白表达也降低,说明高激酶活性ILK修饰的BMSC能通过外泌体这种旁分泌机制调节心肌细胞的凋亡。结论:1.过表达ILK能调节BMSC的存活、增殖,迁移和凋亡,这种调节作用与ILK343位点的激酶活性和359位点的功能活性有关。2.ILK尤其高激酶活性ILK修饰的BMSC抑制了过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。3.ILK修饰的BMSC通过外泌体途径调节过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡。