背景与目的：心肌细胞的死亡，是急性心力衰竭发生和慢性心功能不全进展的主要因素。研究调控心肌细胞死亡的分子机制并寻找促进心肌细胞存活的新靶点，一直是心血管疾病基础研究领域的热点。内质网是心肌细胞内最重要的细胞器之一。内质网平衡是其发挥多种生物学功能的关键。低氧、钙离子失衡、超负荷应激等都会引起内质网应激（ERstress）并激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）。UPR通过缓解内质网应激，恢复内质网平衡，促进细胞存活；也能够通过多种途径激活NF-κB，引起炎症反应。如果内质网应激持续存在且不能缓解，UPR则通过上调促凋亡基因的表达导致细胞凋亡。但是，在内质网应激时，决定细胞最终走向存活或是凋亡的选择机制尚不清楚。既往研究表明，UPR的IRE1和ATF6作用分支影响细胞死亡且作用效果与应激持续时程相关，但是，确切的调控机制有待于进一步研究。CUEDC2（CUE domain containing protein2）是一个功能尚不明确的蛋白质。前期研究发现CUEDC2通过与GADD34相互作用招募蛋白磷酸酶1（Protein phosphatase1,pp1），使IKKβ去磷酸化，抑制NF-κB信号通路的持续激活，从而避免炎症反应过度和自身组织损伤，完成机体对炎症反应的精确调控。此外，CUEDC2还能介导雌激素受体ER和孕激素受体PR的泛素化降解，是乳腺癌耐药的重要原因之一，并证明它能调控细胞周期，最终导致基因组不稳定性和肿瘤发生。但是CUEDC2在心脏中的作用尚无研究报道。生物信息学分析和前期预实验结果均发现CUEDC2在心脏中高表达，提示其可能在心脏发育和功能中具有重要作用。基于CUEDC2对NF-κB活性调节和对多种重要蛋白质泛素化修饰的功能基础，以及UPR和NF-κB活性的相互影响，推测CUEDC2可能在内质网应激调节中有重要功能。因此，本课题拟研究CUEDC2在急性和慢性内质网应激状态下参与细胞存活或凋亡的作用，尤其是对IRE1和ATF6α激活后生物学效应的影响及分子机制。研究方法：本研究分四部分：第一部分：采用生物信息学方法分析CUEDC2基因在心脏中的表达、可能相互作用蛋白质以及可能发生的翻译后修饰，预测CUEDC2在心脏中的作用；利用已经构建成功的CUEDC2基因敲除杂合子小鼠，繁殖、鉴定得到CUEDC2基因敲除纯和子小鼠和同窝野生型对照小鼠，比较Cuedc2^-/-小鼠和野生型小鼠和在发育、心脏结构和生理功能上的差异。第二部分：建立心肌缺血再灌注模型，模拟急性内质网应激，探讨CUEDC2在急性内质网应激中的作用及可能机制。研究利用CUEDC2基因敲除小鼠，通过结扎和释放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注损伤在体模型，评价CUEDC2基因敲除对心肌梗死的影响；分离原代大鼠心肌细胞，用腺病毒载体干涉CUEDC2表达，模拟心肌缺血再灌注损伤，研究CUEDC2在细胞水平对细胞存活的影响，在此基础上，研究CUEDC2影响细胞存活或凋亡的分子机制。第三部分：利用CUEDC2基因敲除小鼠，通过手术制作心室长期超负荷致心肌病理性肥厚和心功能不全动物模型，模拟慢性内质网应激，分别在动物整体和分子水平探讨CUEDC2在慢性内质网应激中的作用及分子机制。第四部分：慢性缺氧也会导致内质网应激。利用慢性缺氧先天性心脏病患儿心肌组织标本，检测CUEDC2在慢性缺氧心肌中的表达变化，在人的组织标本中验证CUEDC2在心肌慢性应激时的表达变化；检测UPR三个作用分支的活性水平，并建立心肌细胞长时间低氧模型和低氧－复氧模型，研究活化程度最高的UPR分支在长期内质网应激中的作用。研究结果：主要结果如下：1、CUEDC2在心脏中高表达；敲除CUEDC2基因后，小鼠的生长、发育不受影响；生理状态下，野生型小鼠和Cuedc2^-/-小鼠在心脏腔室大小和心功能指标上均无显著差异。2、在体动物和离体细胞模型中，缺血再灌注均会导致CUEDC2蛋白质表达水平显著降低；敲除CUEDC2基因后，缺血再灌注损伤所致小鼠心肌梗死面积缩小约30%；在CUEDC2基因敲除的小鼠心肌组织和原代分离培养的MEF细胞中，缺血再灌注所致JNK激活受到明显抑制；原代培养心肌细胞中，干涉CUEDC2基因表达能显著抑制缺血再灌注激活JNK并增加心肌细胞的存活率；在内质网应激时，CUEDC2与IRE1下游效应激酶ASK1发生相互作用，是JNK磷酸化激活的关键。3、通过主动脉缩窄（TAC）致左心室长期超负荷应激，建立心肌肥厚和心功能不全小鼠模型。TAC术后2周心肌组织中CUEDC2蛋白质表达下降；敲除CUEDC2基因后，心肌肥厚程度不受影响，但是显著抑制了心功能不全的发展；TAC术后2周，分离小鼠心肌细胞，测量单细胞的收缩力和钙处理能力，发现CUEDC2基因敲除后心肌细胞收缩力和钙处理能力较野生型心肌细胞更好；TAC术后4周，提取心肌组织总蛋白，检测SERCA2a蛋白质表达，发现CUEDC2基因敲除后SERCA2a蛋白质水平较高，表明SERCA2a稳定性增加；CUEDC2可能通过影响SERCA2a蛋白稳定性和活性参与心室超负荷时心功能不全的发生。4、在慢性缺氧的心肌组织标本中，CUEDC2蛋白质表达显著降低；在低氧培养的心肌细胞中，CUEDC2蛋白质表达量也显著降低，表明CUEDC2在心肌慢性缺氧中可能也发挥着重要的作用；检测UPR三个分支的活性后发现，仅ATF6α分支活性增强，IREα和PERK信号通路的活性无明显变化；进一步在长时间低氧培养的心肌细胞中发现ATF6α的活性升高；干涉ATF6α表达会导致心肌细胞在长时间低氧和缺氧复氧时的凋亡增加，表明ATF6α的活化是心肌慢性缺氧适应的重要调控因子。但是CUEDC2和ATF6之间无相互作用，CUEDC2可能通过其他途径参与心肌慢性缺氧应激。结论：1、CUEDC2在心脏中高表达，但是敲除CUEDC2基因后不影响小鼠的生长、发育和生理状态下心脏腔室大小和心脏功能；2、CUEDC2基因敲除能显著降低缺血再灌注时心肌细胞的死亡并缩小缺血再灌注时心肌梗死面积；急性内质网应激时CUEDC2调节IRE1-ASK1-JNK信号通路，参与心肌细胞死亡的发生；3、CUEDC2基因敲除不影响心室长时间超负荷时心肌细胞肥厚，但是能显著抑制心功能不全的进展；调节SERCA2a蛋白稳定性和活性是CUEDC2参与心功能不全发生和进展的分子机制；CUEDC2可能对慢性应激时心肌细胞的功能起负性调控作用；4、慢性缺氧时CUEDC2蛋白质表达下降，ATF6α活性增加。持续活化的ATF6α参与心肌慢性缺氧适应并在心肌细胞缺氧－复氧损伤时对心肌细胞产生保护性效应；CUEDC2与ATF6α无相互作用，可能通过其他途径参与心肌慢性缺氧损伤。