[研究背景]子宫内膜癌(endometrial cancer)是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,在所有妇科恶性肿瘤中占6%。流行病学的数据调查显示,在过去的二十年中,全球范围内子宫内膜癌的发病率在不断增加,而宫颈癌的发病率在逐步下降。2015年对子宫内膜癌发病率的调查显示,美国境内新增病例达到54870例,新增死亡病例约为10170人。子宫内膜癌的生物学改变和组织学形态上的表现多种多样,传统上基于组织学形态、分子生物学的改变和预后情况,将子宫内膜癌分为两型:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型癌最为多见,以宫内膜样癌为代表,肿瘤呈内膜样分化,肿瘤级别低,与雌激素的过度表达和持续刺激有关。临床进展缓慢,预后较好。Ⅱ型癌绝多大数为浆液性癌,分化差,与雌激素无关,临床表现为侵袭性强,预后差。由于子宫内膜癌的临床症状较为明显,因此大部分病例早期即得到确诊并及时的治疗,即便如此,仍有5-15%的患者出现死亡。大部分子宫内膜癌的患者为绝经后女性,但是也有约2%-14%的患者为年轻女性(≤40岁),由于年轻患者大部分还有生育要求,使得子宫内膜癌的治疗变得尤为复杂。因此,深入探讨子宫内膜癌发展和进展过程中相关的分子改变,深入了解子宫内膜癌的发病机制,对于肿瘤的治疗和预防是十分有益的。CIP2A,即蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of proteinphosphatase 2A)是最近研究较多的癌基因,CIP2A曾被命名为KIAA1524或P90。目前的研究显示,CIP2A是一种癌基因,在多种恶性肿瘤和增生中呈现高表达,与肿瘤的发生进展及不良预后有良好的相关性。由于CIP2A在大部分正常的组织和细胞中表达水平较低,因此它有可能是一种特异性的肿瘤生物学标志物,深入研究其作用机制和功能,对了解肿瘤的发病机制,开展基因靶向治疗具有重要的意义。目前关于CIP2A基因在子宫内膜癌中表达及其生物学作用的研究比较少,由于子宫内膜癌中,子宫内膜样腺癌的发病率最高,因此在本课题中,我们首先选子宫内膜样腺癌的病例,通过免疫组化、RT-PCR和WesternBlot检测CIP2A的表达在肿瘤组织和正常内膜组织中有无区别。用相应的统计学方法分析CIP2A与子宫内膜样腺癌的临床病理特点有无相关性。本课题还将通过构建小干扰RNA(siRNA)转染至不同的子宫内膜癌细胞株,应用CCK-8、Transwell侵袭实验、流式细胞术等技术方法观察沉默CIP2A基因的表达后肿瘤细胞功能的变化,旨在探讨CIP2A基因对肿瘤生长、增殖、侵袭及凋亡的作用和调控,以及CIP2A的表达和增殖、凋亡相关的蛋白之间的相互作用,研究CIP2A基因对信号通路表达的调控机制。本课题拟解决以下几个问题:(1)CIP2A在子宫内膜样腺癌和正常增生内膜的表达有无差异。(2)CIP2A的表达与临床病理资料的关系。(3)CIP2A与子宫内膜样腺癌预后的关系。(4)CIP2A在子宫内膜样腺癌恶性进展中的生物学作用。[实验方法]1、研究病例标本的选择选取山东省滨州医学院附属医院病理科存档的病例及蜡块,包括150例子宫内膜样腺癌(Endometrioid adenocarcinoma,EAC)、14例子宫内膜不典型增生(Endometrial atypical hyperplasia,EAH)、20例子宫内膜增生症(Endometrial hyperplasia,EH)及30例正常增生期子宫内膜(Normal endometrium,NE)。选取病例的所有切片都进行重新的阅片和判读。2、免疫组化及相关性分析免疫组化检测150例子宫内膜样腺癌中CIP2A的表达情况,并设定染色强弱的判定标准,应用统计学分析CIP2A在EAC,EHA,EH和NE的表达情况,比较各组之间的差异,分析CIP2A的表达与EAC临床病理特点(年龄、FIGO分期、组织学级别、淋巴结转移)之间的相关性,以及CIP2A表达与ER、PR、Ki-67表达的相关性、以及与患者预后之间的关系。3、生存分析利用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,采用Logrank检验对CIP2A不同表达水平的子宫内膜样腺癌患者的总体生存率进行统计分析,探讨CIP2A的表达与子宫内膜样腺癌患者生存率的关系。通过Cox比例风险回归模型单因素和多因素统计分析,进一步研究CIP2A能否作为预测子宫内膜样腺癌患者预后的独立危险因素。4、新鲜组织中CIP2A的表达收集14例新鲜的子宫内膜样腺癌组织和癌旁正常的内膜组织,应用RT-PCR、Western Blot等方法检测新鲜的肿瘤组织和正常内膜组织中CIP2A的mRNA水平及蛋白水平,统计学分析CIP2A在癌组织和正常组织中表达的差异性。5、细胞培养及转染设计合成CIP2AsiRNA及作为阴性对照(Negative control)片段,对细胞系进行转染,培养24小时后,通过RT-PCR检测ishikawa、An3ca及KLE细胞系中CIP2AmRNA的表达情况,分别于培养24小时、48小时后,应用Western blot和RT-PCR检测CIP2A蛋白表达情况。总体评价转染效率。6、检验沉默CIP2A基因后子宫内膜癌细胞功能的变化①细胞侵袭、迁移能力分析:利用Transwell实验检测CIP2A基因沉默后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的变化;②细胞增殖检测:CCK-8法检测siRNA干扰CIP2A的表达后对肿瘤细胞增殖能力的影响;③克隆/集落形成实验:检测CIP2A基因沉默后,肿瘤细胞空间克隆/集落形成能力的变化;④细胞凋亡检测:siRNA干扰CIP2A后,用AnnexinV-FITC凋亡试剂盒染色,流式细胞仪上检测肿瘤细胞凋亡的变化。[实验结果]1、CIP2A在子宫内膜样腺癌中的表达明显升高免疫组织化学结果显示,CIP2A的阳性着色部位在细胞浆和细胞核,表现为细胞核和细胞浆的弥漫着色。按照CIP2A表达水平高低的计算方法,结合阳性肿瘤细胞的比率,CIP2A在NE、EH、EAH及EAC组织中的阳性率分别为为26.7%、40%、42.9%和87.3%,其差异具有统计学意义(P<0.01),表明CIP2A的阳性率在EAC中要高于正常内膜及增生症、非典型增生的内膜病变。150例EAC中,CIP2A的阳性率为87.33%(131/150),79例呈现CIP2A高表达,52例呈现CIP2A的低表达,19例为阴性表达。RT-PCR和Western blot检测结果与免疫组化结果相一致,无论是mRNA或是蛋白的表达水平,CIP2A在EAC组织中的表达水平均高于正常的增生期内膜组织。2、CIP2A的表达与子宫内膜样腺癌的临床病理特征之间的相关性统计分析表明,CIP2A的高表达与EAC的组织学分级、FIGO分期、宫颈管受累情况、P53蛋白的表达及ki-67增殖指数具有明显的相关性,CIP2A蛋白的表达与病人年龄、肌层侵犯的深度、脉管内癌栓以及ER、PR的表达未见明显相关性。3、生存分析结果150例子宫内膜样腺癌患者的五年生存率为96%。Kaplan-Meier分析结果显示CIP2A高表达与患者生存期缩短相关,其余预后不良的因素还包括较高的FIGO分期、肿瘤低分化、肌层侵犯较深以及较高的Ki-67增殖指数等。Cox比例风险模型显示,较高的FIGO分级、低分化的肿瘤组织和脉管内癌栓的存在是影响EAC患者预后的独立危险因素。而CIP2A的高表达并非独立的预后影响因子。4、检测三株子宫内膜癌细胞系中转染CIP2AsiRNA后的敲减效率通过转染CIP2AsiRNA沉默CIP2A在KLE、ishikawa、An3ca中的表达,研究结果显示,24小时后三株细胞系CIP2AmRNA均降低,敲减效率分别为34%、62%、68%。48小时RT-PCR显示CIP2AsiRNA敲减效率分别别为61%、85%和82%。Western Blot显示转染CIP2AsiRNA后,可明显抑制ishikawa、An3ca细胞内蛋白的表达。因此选用敲减效率较高的ishikawa和An3ca的细胞株进行后续的功能实验。5、siRNA干扰CIP2A后对子宫内膜癌细胞侵袭、增殖和凋亡的影响①细胞侵袭、迁移能力分析:siRNA沉默子宫内膜癌细胞株ishikawa、An3ca中CIP2A基因,使其低表达后,子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力明显减弱。②细胞增殖检测:CCK-8增殖实验结果显示,在两株子宫内膜癌细胞中沉默CIP2A基因后,继续细胞培养72h后,肿瘤细胞的增殖能力较空白对照组细胞明显降低,差异具有显著的统计学意义。③平板克隆实验:结果显示,沉默CIP2A基因的表达,两株子宫内膜癌细胞的克隆/集落形成的能力明显降低(P<0.05)。④流式细胞术:siRAN干扰CIP2A后,与对照组相比,子宫内膜癌细胞的凋亡率均增加。在ishikawa细胞株中,siRNA干扰组的癌细胞凋亡率明显升高,与对照组比较有统计学意义,而在An3ca细胞株中,两组间凋亡率的差异并没有统计学意义。6、在ishikawa和An3ca细胞系中沉默CIP2A的表达后,CyclinD1和c-Myc的表达降低,在ishikawa细胞系中,caspase-3的表达上调。Western Blot实验结果显示,在ishikawa和An3ca细胞系中沉默CIP2A的表达后,cyclinD1和c-myc的表达下降,而P53,Bcl-2和mTOR并无改变。在ishikawa细胞株中,caspase-3的表达上调,而在An3ca细胞株中caspase-3的表达并无改变。以上结果显示,CIP2A可以通过上调CyclinD1和c-Myc促进细胞的增殖,通过下调caspase-3的表达水平对细胞凋亡起到抑制的作用。[结论]1、CIP2A蛋白在子宫内膜样腺癌组织中高表达,且与子宫内膜样腺癌的FIGO分期、组织学分级、Ki-67增殖指数以及P53蛋白的表达有统计学关联。2、生存分析显示,CIP2A表达水平较高的患者总体生存时间缩短,提示CIP2A高表达是预后不良的因素之一。另外,较高的FIGO分期,肿瘤分化程度较低、较深的肌层浸润、P53高表达和较高的Ki-67增殖指数均与不良预后相关。Cox比例风险回归模型分析显示,较高的临床分期、肿瘤分化程度低及脉管内癌栓是影响患者预后的独立危险因素,而CIP2A蛋白的高表达并非患者预后的独立影响因素。3、沉默子宫内膜癌细胞中的CIP2A基因的表达,肿瘤细胞的增殖及克隆能力明显降低、,肿瘤细胞迁移及侵袭能力明显下降,肿瘤细胞的凋亡率增加,表明CIP2A可以调控肿瘤的增殖和凋亡,从而影响其发生和发展。因此,针对CIP2A开发基因治疗的药物,有可能成为子宫内膜癌治疗的新靶点4、对信号通路各蛋白表达的分析结果表明,CIP2A的对肿瘤细胞的增殖和调控是通过对原癌基因C-myc,细胞周期调控基因CyclinD1,凋亡相关基因caspase-3的调控实现其作用的。