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本研究的目的是通过构建人源性LASS2基因的真核表达载体,建立稳定过表达LASS2蛋白的HCCLM3细胞株,来研究LASS2基因在肿瘤转移中的作用及相关机制。本研究分三部分进行。在第一部分中,着重于LASS2基因对HCCLM3肝癌细胞转移影响的研究,分三组实验进行。1、LASS2基因在不同转移潜能肝癌中表达情况的检测:Northern blot结果显示,高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3中LASS2基因的表达水平比低转移潜能肝癌细胞系MHCC97-L要低;对20例临床肝癌样本原位癌组织(已转移组10例,未转移组10例)的检测结果显示,已转移组的LASS2基因的表达水平比未转移组低。2、LASS2基因对HCCLM3细胞转移能力影响的体外实验:通过构建真核表达载体pCMV-HA2-LASS2,并将其转染至高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3,经G418筛选,我们建立了稳定过表达LASS2基因的HCCLM3细胞系。通过划痕实验及体外侵袭实验,证实了LASS2基因在HCCLM3细胞中过表达后,HCCLM3细胞在迁移、侵袭等转移能力上受到了明显的抑制。3、LASS2基因对HCCLM3细胞转移能力影响的裸鼠体内实验:裸鼠体内实验结果证实,当LASS2基因稳定过表达时,HCCLM3细胞的转移能力受到抑制。同时,我们采用原位酶谱方法,对裸鼠的肝移植瘤组织进行MMP-2/MMP-9的活性进行检测,发现LASS2基因抑制了HCCLM3细胞MMP-2/MMP-9的激活。LASS2基因在高转移潜能肝癌中低表达,在低转移潜能肝癌中高表达;综合体外及体内肿瘤转移实验的结果,以及LASS2基因在HCCLM3细胞过表达后,HCCLM3细胞MMP-2/MMP-9在激活方面的变化,这些证实LASS2基因对肝癌细胞HCCLM3的转移具有显著地抑制作用;结合在前期研究中,我们发现LASS2与V-ATPase的ATP6L亚基相互结合,提示LASS2基因抑制肝癌细胞HCCLM3转移的机制可能与LASS2蛋白结合ATP6L亚基后抑制V-ATPase的活性相关。在第二部分中,着重于LASS2对V-ATPase泌氢功能影响的研究,分三组实验进行。1、LASS2与ATP6L相互结合的研究:通过蛋白亚细胞共定位实验、co-IP(Co-immunoprecipitation,co-IP)实验、荧光共振能量转移实验(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)等实验,我们确认LASS2与ATP6L可以相互结合;在蛋白亚细胞共定位实验中,发现ATP6L的定位发生改变。2、LASS2对ATP6L影响的研究:荧光淬灭后能量恢复实验(Fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)实验结果证实,LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的运动。3、LASS2对V-ATPase泌氢功能影响的研究:ATP6L的northern blot检测结果显示,LASS2基因在HCCLM3细胞内稳定过表达后,ATP6L的表达并未发生明显改变,LASS2基因在HCCLM3细胞内稳定过表达后,ATP6L的表达并未发生明显改变,但LASS2组细胞培养液培养12小时后细胞泌氢较对照组减少,且LASS2组细胞的pHi在NH4~+诱导酸化后恢复受阻;同时,用激光共聚焦显微镜对活细胞进行观测时发现,当细胞处于对酸过载的反应期时,对照组细胞内出现ATP6L-GFP蛋白的局部富集,而LASS2组细胞内的ATP6L-GFP蛋白未发生变化。通过蛋白亚细胞共定位实验、co-IP实验、FRET等实验,我们确认LASS2与ATP6L可以相互结合;FRAP实验结果证实,LASS2蛋白可以抑制ATP6L蛋白的运动;LASS2组细胞培养液培养12小时后细胞泌氢较对照组减少,且LASS2组细胞的pHi在NH4~+诱导酸化后恢复受阻;激光共聚焦显微镜的观测结果显示,当细胞处于对酸过载的反应期时,对照组细胞内出现ATP6L-GFP蛋白的局部富集,而LASS2组细胞内的ATP6L-GFP蛋白未发生变化。上述结果证实LASS2基因对V-ATPase的泌H~+能力具有抑制作用,并提示其作用机制与LASS2蛋白结合ATP6L亚基并抑制其运动相关。在第三部分中,着重于LASS2影响HCCLM3细胞对酸性微环境应答的研究,分三组实验进行。1、在酸性微环境中,LASS2对HCCLM3细胞溶酶体影响的研究:我们使用吖啶橙染料对活细胞的溶酶体进行染色,使用激光共聚焦显微镜对活细胞进行观测。成像结果显示,当培养基由碱性(pH 7.4)变为酸性(pH6.6)时,对照组细胞内的溶酶体由核周向细胞边缘及细胞触角内迁移,而LASS2组细胞内溶酶体的位置无改变。2、在酸性微环境中,LASS2对HCCLM3细胞MMP-2影响的研究:当LASS2组与对照组细胞分别用不同pH值(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.6)的细胞培养基培养后,通过对细胞蛋白及无血清细胞培养上清用MMP-2抗体进行western blot检测,结果显示,LASS2基因对细胞内的MMP-2合成并无影响,但抑制细胞MMP-2的分泌。而以明胶(A型)为底物的进行Zymography分析及细胞原位酶谱实验,结果显示LASS2组细胞MMP-2的激活受到了明显的抑制。当细胞外周微环境向酸性变化时,LASS2依然抑制MMP-2的分泌与激活。3、在酸性微环境中,LASS2对HCCLM3细胞转移影响的研究:体外肿瘤细胞侵袭实验、迁移实验、黏附实验证实,当细胞外周微环境向酸性变化时,LASS2依然明显抑制HCCLM3细胞的转移。上述结果进一步证实,LASS2蛋白结合ATP6L亚基后,通过抑制ATP6L在细胞内的移动,不仅导致V-ATPase的失活,还导致了肿瘤细胞内的溶酶体在酸性微环境的下无法从胞核周向细胞触角及细胞膜边缘迁移,从而导致肿瘤细胞MMP-2的分泌与激活受到明显的抑制,并造成肿瘤细胞在酸性微环境下的转移能力无明显改变。本文通过相关实验,进一步证实了ATP6L是抑制肿瘤生长的有效标靶,同时首次报道LASS2通过与ATP6L结合后,不仅抑制了V-ATPase的活性,还导致了肿瘤细胞内的溶酶体在酸性微环境的下无法从胞核周向细胞触角及细胞膜边缘迁移,从而明显抑制了肿瘤的转移。本文的结果为研究肿瘤转移机制以及探索抑瘤转移方法提供了参考。