研究背景肝郁脾虚证是以出现肝失疏泄、脾失健运相关的病理改变为主的一种中医临床常见证候。《素问》曰:“人或患怒,气逆上而不下,即伤肝也”、“脾藏意,在志为思”、“思则伤脾”、“余知百病生于气也,……,思则气结”、《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》曰:“见肝之病,知肝传脾,当先实脾,四季脾旺不受邪,即勿补之”。上述这些论述均可说明肝郁脾虚证与人的情志变化和肝脾功能联系紧密,情志不畅等应激刺激可以导致人体生理改变、免疫功能失常以及神经内分泌紊乱等。抑郁症是全球最严重的精神疾病之一,并危及人的生命的健康,抑郁症的临床病理机制尚不明确,各类治疗效果也不一致,因此被认为是一种异质性疾病,并且肝郁脾虚证也是其主要证候类型之一。炎症是机体抵抗外界损伤或疾病发生发展的一种防御性免疫应答,涉及多种疾病和人体各个系统的病理变化。慢性炎症可持续引发细胞功能紊乱,继而引发组织器官功能紊乱和疾病的发生,是疾病发展的关键环节,其导致多种慢性疾病的作用机理已经是现代研究的热门课题之一。在现代研究中发现,抑郁症的发病机制包含免疫系统激活和炎症细胞因子的释放,且肝郁脾虚证涉及中医临床中内、外、妇、儿等多种疾病,发病机制十分复杂,并且与慢性炎症的发生有一定的关联。因此,对慢性炎症物质基础进行研究是解析肝郁脾虚证候机理的一条重要途径。近年来随着对细胞死亡机制研究的深入,发现细胞的坏死并非是无序的,而是具有确切调控分子机制的程序性坏死过程。坏死性凋亡除了会引起显著而广泛的炎性反应外,还是神经元死亡的一种重要方式,涉及多种中枢神经系统损伤机制,同时也包含在肝细胞死亡和肝损伤等相关疾病的机制之中。肝郁脾虚证作为临床的一种常见证候,其发病机制涉及神经内分泌、免疫、消化、代谢等机体多个系统和功能的改变。因此可以推测,肝郁脾虚证的发生和发展可能与坏死性凋亡途径介导的慢性炎症存在一定的联系。研究慢性炎症与坏死性凋亡的相关机制能够为探索坏死性凋亡和肝郁脾虚证之间的联系搭起一座桥梁,以此也能进一步充实肝郁脾虚证的科学内涵。研究目的从目前的研究来看,脂质运载蛋白Lipocalin-2发挥其关键作用的位点在抑郁症和肝郁脾虚证的机制,以及逍遥散作用机理所包含的部位高度重叠,都涉及中枢神经系统、免疫炎症反应、肝脏功能、糖脂代谢以及能量代谢,并且都极有可能与坏死性凋亡途径存在一定的联系。因此,本研究旨在探讨肝郁脾虚证的现代生物学基础是否包括坏死性凋亡途径介导的慢性炎症机制,观察逍遥散能否调节坏死性凋亡途径,以及炎症相关功能蛋白Lipocalin-2是否能作为逍遥散治疗抑郁症肝郁脾虚证的潜在靶点,以期能为逍遥散的应用提供新的理论依据与实验支持,同时也从炎症致病的角度为方证相关的肝郁脾虚证现代研究提供新的思路。研究方法(1)造模采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)的方法复制了小鼠抑郁症肝郁脾虚证候病证结合模型。通过小鼠的一般状态以及糖水偏好、强迫游泳、新环境抑制进食、旷场实验等行为评价手段对模型小鼠的“肝郁”表现进行客观评价,然后通过血清D-木糖、体重、进食量等方法评价模型动物的“脾虚”表现。同时通过以方测证,观察逍遥散对抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠的治疗作用。(2)检测坏死性凋亡途径在抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠海马中的发生情况。采用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1阻断坏死性凋亡的相关途径,通过Western Blot、免疫组化检测坏死性凋亡途径中关键蛋白质RIPK1、RIPK3和MLKL的表达情况,通过Western Blot、免疫组化以及免疫荧光观察MLKL的磷酸化水平以确认坏死性凋亡是通过RIPK1/3介导的MLKL所激活。(3)检测海马 IL-1β、Lipocalin-2 和 Iba-1 以及下丘脑 IL-1β、Lipocalin-2、MC4R 的表达情况,以此探讨Lipocalin-2参与的中枢海马小胶质细胞活化和MC4R抑食通路与肝郁脾虚证中枢炎症的相互关系。(4)检测血清ALT、AST、DBIL、TBIL以及TBA的含量水平,之后观察肝脏组织中IL-1β和炎症相关功能蛋白Lipocalin-2的蛋白和基因水平,以此探讨Lipocalin-2的表达与肝郁脾虚证相关的炎性肝损伤之间的联系。(5)观察逍遥散对坏死性凋亡途径介导的慢性炎症和Lipocalin-2功能的调节作用,从炎症致病的角度分析逍遥散治疗抑郁症肝郁脾虚证的中枢和外周机制,以此进一步诠释肝郁脾虚证的现代科学内涵。研究结果(1)实验一采用6周CUMS的造模方法复制了抑郁症肝郁脾虚证小鼠病证结合模型,通过小鼠的一般状态表现,体重与进食量变化,血清D-木糖含量,糖水偏好实验、强迫游泳实验、新环境抑制进食实验和旷场实验等行为学评价方法,并结合逍遥散的治疗作用,以方测证对模型进行了评价。(2)实验二证实了坏死性凋亡途径的激活与CUMS诱导的模型小鼠海马功能紊乱密切相关,探讨了坏死性凋亡在抑郁症肝郁脾虚证发病中的可能机制。与此同时,发现逍遥散的治疗作用可能是通过改善模型小鼠海马RIPK1,RIPK3,MLKL的基因蛋白表达及MLKL的磷酸化水平,调节坏死性凋亡途径,从而缓解海马的神经炎症与小胶质细胞活化。(3)实验三发现抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑中MC4R抑食通路的表达可能与坏死性凋亡途径的激活存在一定联系。同时,发现逍遥散对模型小鼠摄食调节的作用机制可能与改善小鼠坏死性凋亡水平,调节Lipocalin-2的表达从而干预下丘脑室旁核MC4R相关的食欲调节通路有关。(4)实验四观察了抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠肝脏功能的变化,并且进一步证实了坏死性凋亡与模型小鼠肝脏功能紊乱有关,同时发现逍遥散对模型小鼠的肝功能损伤具有明显的治疗作用,并且这一作用机制可能与逍遥散改善坏死性凋亡水平,调节Lipocalin-2的表达有关。结论本实验成功复制了小鼠抑郁症肝郁脾虚证的病证结合模型,并且通过观察中药复方逍遥散对模型小鼠一般状态及行为学变化的有效干预作用从方证对应上进行了验证。同时,发现坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1也对模型小鼠的行为变化具有一定的调节作用,表明抑郁症和肝郁脾虚证的发病机制中可能存在坏死性凋亡途径的激活。研究中发现抑郁症肝郁脾虚证模型小鼠海马神经炎症的发生及小胶质细胞过度活化与坏死性凋亡的发生存在联系,并且坏死性凋亡可能通过调节炎症相关活性蛋白Lipocalin-2参与了抑郁症和肝郁脾虚证的MC4R依赖食欲调节机制以及慢性炎症相关的肝脏功能损伤机制。与此同时,中药复方逍遥散对抑郁症和肝郁脾虚证的作用功效可能与坏死性凋亡的上述途径有关。