【背景】阿尔茨海默病是一类中枢神经系统最为常见的神经退行性疾病，主要临床表现为痴呆、记忆缺失、性格改变及语言障碍。其不仅起病隐匿、病情迁延渐进、痴呆症状严重干扰病人日常生活，发病率也呈现年轻化、加重的趋势。美国在2000年的阿尔茨海默病发病例数约为450万例，而中国最新的调查发现阿尔茨海默病患病率在60岁以上人群中为2.21%，65岁以上为3.00%，70岁以上高达4.69%。面对如此严重的病情和庞大的患病人群，阿尔茨海默病的治疗却仍处于药物局限、疗效欠佳的阶段。因此寻求一种能够有效、安全治疗阿尔茨海默病的药物和方法迫在眉睫。祖国传统医学电针（Electroacupuncture，EA）刺激相应穴位能够对多种中枢神经系统性疾病产生明显的神经保护作用并能进一步改善疾病所致神经行为学缺损。本实验室先前的研究已经证实电针刺激“百会穴”可诱导中风后脑的快速相和延迟相的缺血耐受，显著降低脑梗死容积并对中风后学习认知功能损伤具有明显的改善作用。电针在高持续性正加速度所致中枢神经损伤中也具有显著改善神经行为学表现的作用。此外，国内外大量的研究证实电针刺激可促进损伤部位脑组织神经发生数量的增加，这可能与电针的脑保护作用密切相关。但电针刺激对同为神经病变的阿尔茨海默病是否也具有改善行为学表现和促进神经发生的作用目前并不十分明确。目前得到国内外权威机构公认的是阿尔茨海默病的发生与脑内β样淀粉酶斑块异常沉积、神经纤维缠结和选择性神经元缺失密切相关，其中β样淀粉酶斑块的异常沉积在发病过程中最为重要。阿尔茨海默病病人淀粉样前体蛋白（APP）和早老素-1（PS1）基因突变的代谢产物Aβ1-42是β样淀粉酶斑块的重要组成成分，同时其神经毒性作用也介导了脑内神经元细胞的大量死亡。神经发生是指神经干细胞或神经先祖细胞在诱导因素作用下产生新生神经元的过程，成体脑区的神经发生具有个体成长的功能和治疗的意义。阿尔茨海默病病人在β样淀粉酶斑块和年龄的双重作用下脑内神经发生数量明显减低，这也从某种意义上进一步加剧了此病的发生。脑源性神经营养因子（BDNF）是一类在中枢神经系统神经元发生、分化和存活过程中起重要作用的蛋白质，参与轴突可塑性的调节、神经元分化和存活、神经保护、神经元损伤后的神经发生。基于以上论述我们验证，电针刺激“百会穴”通过减少脑内β样淀粉酶斑块的异常沉积、上调BDNF表达并促进神经发生实现对阿尔茨海默病的治疗作用，完成从病理学表现到行为学表现的飞跃，从而为临床治疗阿尔茨海默病提供一种新的、简便的治疗手段。本实验选用APP/PS1双转基因小鼠模型模拟人类阿尔茨海默病完成对本实验的系统性研究。实验一阿尔茨海默病双转基因小鼠的构建与鉴定【目的】构建阿尔茨海默病双转基因小鼠模型并对模型构建情况进行评估鉴定【方法】2月龄的APP和PS1基因突变的雄性C57小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。2月龄正常健康雄性C57小鼠购自第四军医大学实验动物中心。1）两组动物分别于2月龄、7月龄和10月龄进行Morris水迷宫测试，监测随着月龄的推移实验动物空间学习和空间记忆功能的改变。2）两组动物分别于2月龄、7月龄和10月龄进行免疫组织化学双标染色，每组动物每个时间点8只，监测随着月龄的推移脑内β样淀粉酶沉积情况的变化。从病理学和神经行为学表现两个方面验证阿尔茨海默病双转基因小鼠模型的构建情况。【结果】水迷宫结果显示：阿尔茨海默病双转基因小鼠于2月龄时与对照组野生型C57小鼠相比其空间学习和记忆功能无显著差异。于7月龄时，阿尔茨海默病双转基因小鼠的空间学习记忆功能明显低于同月龄对照组小鼠（P<0.05），10月龄时此种神经行为学损伤表现进一步加重。同时，与神经行为学结果相一致的是，免疫组织化学双重染色结果显示阿尔茨海默病模型小鼠脑内海马和皮层部位β样淀粉酶的沉积于2月龄时与对照组相比无明显差异。于7月龄和10月龄时沉积量明显增加。说明此小鼠于7个月龄时发生了明显的空间学习记忆功能缺失和β样淀粉酶的大量异常沉积，也即发生了阿尔茨海默病。于10月龄时，此神经行为学表现缺损和Aβ的异常大量沉积有增加趋势。【结论】阿尔茨海默病双转基因小鼠构建成功，可用于后续阿尔茨海默病治疗方法的进一步探讨。实验二EA刺激对阿尔茨海默病双转基因小鼠病理学及神经行为学表现的影响【目的】探讨电针刺激“百会穴”对阿尔茨海默病双转基因小鼠脑内Aβ异常沉积和神经行为学缺损的影响。【方法】实验分组：将48只雄性阿尔茨海默病小鼠随机分为两组：电针治疗组（APP+EA组）和对照组（APP组）（n=24）；将48只健康雄性C57小鼠随进分为两组：电针治疗组（Con+EA组）和对照组（n=24）。1）研究电针刺激对阿尔茨海默病双转基因小鼠空间学习和记忆功能的影响。电针刺激部位选取小鼠耳缘前线中点“百会穴”，刺激参数为强度1mA、频率2/15HZ、疏密波，30分钟/天、5天/星期，共刺激28天。电针刺激过程中使小鼠肛温保持在37.0±0.5℃，面罩给氧流量为1L/min。电针刺激后次日行水迷宫测试检测小鼠神经行为学表现。2）研究电针刺激对阿尔茨海默病小鼠脑内Aβ沉积的影响。水迷宫测试完毕后取脑行免疫组织化学双重染色、Elisa和Western blot检测EA刺激对脑内Aβ表达水平的影响。【结果】1）电针刺激后水迷宫结果显示，与APP组相比，APP+EA组小鼠空间学习和记忆功能缺损显著改善，表现为目标象限时间的延长和平均逃避潜伏期的缩短（P<0.05）。同时，Con+EA组与Con组相比其空间学习和记忆功能的缺损也表现出了轻微的改善（P<0.05）。而APP组和APP+EA组小鼠的神经行为学表现较对应的Con组和Con+EA组为差。2）免疫组织化学双重染色将Aβ的表达定位于海马和皮层部位神经元的胞质内，其在APP+EA组小鼠脑内的表达水平较APP组为底，在Con+EA组小鼠脑内的表达较Con组为低。与相应的对照组比较，定量检测方法ELISA和Westernblot的结果也显示EA刺激明显降低了阿尔茨海默病小鼠和健康小鼠脑内Aβ的表达水平（P<0.05）。【结论】电针刺激改善了阿尔茨海默病小鼠的神经行为学缺损、降低了脑内Aβ的表达水平，对阿尔茨海默病具有明显的治疗作用。实验三EA刺激对阿尔茨海默病双转基因小鼠治疗作用的机制研究【目的】探讨电针刺激对阿尔茨海默病小鼠产生治疗作用的相关机制。【方法】实验分组同前。1）研究电针刺激对小鼠BDNF表达的影响。各组小鼠于水迷宫测试后行多聚甲醛灌注固定，取脑后进行冰冻切片免疫组织化学双标染色，观察BDNF与神经元的共定位情况。同时，海马和皮层部位的新鲜脑组织研碎后提取全蛋白行Western blot分析，定量检测脑内BDNF的表达水平。2）研究电针刺激对脑内神经发生数量的影响。各组小鼠处死前35天起腹腔注射100mg/kg/day的新生神经元DNA标记物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）连续7天。最后一次注射药物后28天行灌注取脑并行冰冻切片，免疫组织化学双重染色标记新生神经元。【结果】1）免疫组织化学双标染色结果发现：BDNF与神经元具有共定位现象。Western blot检测发现：与APP组相比，APP+EA组小鼠脑内BDNF的表达水平明显增高（P<0.05）。同时，Con+EA组与Con相比，BDNF的表达也出现了水平增加的现象（P<0.05）。APP组和APP+EA组BDNF的表达水平均低于相应的Con相和Con+EA组。2）与APP组相比，APP+EA组小鼠脑内新生神经元的数量明显增加（P<0.05）。Con+EA组与Con相比，新生神经元的发生数量也出现了增加的现象（P<0.05）。【结论】电针刺激对AD小鼠产生治疗作用的潜在机制是通过促进脑内BDNF的表达和神经发生实现的。总结应用APP/PS1双转基因小鼠，我们的研究发现，电针刺激“百会穴”能够显著改善阿尔茨海默病双转基因小鼠的认知功能，其机制可能与电针减轻β样淀粉酶沉积、上调脑内BDNF并促进神经发生等有关，为将电针应用于临床治疗阿尔茨海默病提供新的治疗手段和理论依据。