目的:对清开灵注射液生产过程中的提取、纯化、水解、配液等整个流程进行全面、系统的优化研究,明确清开灵注射液关键生产单元的工艺参数。方法:清开灵注射液生产过程中,板蓝根、栀子、金银花三味药材分别提取纯化以提取液形式入药,水牛角、珍珠母需分别水解、再中和、纯化后入药,经四混、六混及其醇沉、八混、活性炭脱色、超滤、灌封等形成最终产品。本课题通过对清开灵注射液各生产单元及未明确的工艺参数进行细化、优化,确定清开灵注射液最优的生产工艺,以期稳定终产品质量。1.板蓝根、栀子、金银花提取工艺优化。(1)板蓝根、栀子、金银花分别以各提取液中(R,S)-告依春、栀子苷、绿原酸及木犀草苷含量为指标,通过加水量的考察,优化清开灵注射液中的提取工艺;(2)在提取加水量优化的基础上,对各浓缩液相对密度进行考察。2.板蓝根液、金银花液的纯化工艺优化。(1)在板蓝根提取工艺优化的基础上,以板蓝根液中(R,S)-告依春含量为评价指标,对板蓝根液的氨沉工艺和活性炭脱色工艺进行优化,确定适宜的pH值、活性炭的用量及脱色时间;(2)在已优选出金银花最佳提取工艺的基础上,以绿原酸和木犀草苷含量的综合评分为指标,采用正交试验法对加醇时药液温度、搅拌速度和加醇速度3个影响较大的因素进行考察,对其水提液的精制工艺进行优化。3.珍珠母、水牛角的水解纯化工艺优化。(1)采用电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)对水解混合液中具有安全隐患的钡离子含量进行限定;并以钡离子与含氮量为指标,采用正交试验法,优化清开灵注射液生产过程中的水解工艺参数,即氢氧化钡及硫酸溶液的加入量、氢氧化钡及硫酸溶液的浓度和水解时间。(2)对水解混合液pH值、水解混合液相对密度进行考察,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测水解混合液中蛋白质分子量范围。4.清开灵注射液配液工艺优化。(1)以药液中有效成分综合评分为指标,对四混液、六混液加入顺序,六混液醇沉pH值,配液pH值,活性炭脱色工艺及超滤膜膜孔径进行优化;(2)通过对清开灵注射液灌封充氮方式(前充氮、后充氮、前后两次充氮)的考察,确定最优灌封方式,以保证清开灵注射液的稳定性。(3)在各中间体工艺优化的基础上,对其进行储存时间的考察。结果:1.板蓝根、栀子、金银花提取工艺优化。(1)加水量优化结果为:板蓝根一煎6倍,二煎4倍;栀子一煎6倍,二煎5倍;金银花一煎10倍,二煎6倍;(2)板蓝根、栀子、金银花浓缩液相对密度分别为:(1.1167±0.0251)g·mL-1(60℃)、(1.0833±0.0153)g·mL-1(60℃)、(1.0933±0.0153)g·mL-1(60℃)。2.板蓝根液、金银花液的纯化工艺优化。(1)对板蓝根液的加热除氨工艺进行考察,最终确定加氨调节药液pH值至8.5,加热除氨后调节药液pH值至6.1,为板蓝根液的纯化工艺参数的设置提供依据;活性炭脱色工艺所用活性炭用量为1.0%生药量,脱色时间为15min;(2)金银花水提取液最佳醇沉参数:醇沉时药液温度为20℃,搅拌速度240 r·min-1,加醇速度1倍生药量/min。3.珍珠母、水牛角的水解纯化工艺优化。(1)水解混合液最佳制备工艺条件为:硫酸、氢氧化钡溶液的加入量为8倍量,浓度为1.5 mol/L,水解时间为7h;(2)水解液合并后调节pH值至3.8;浓缩后相对密度为(1.0163±0.0020)g·mL-1(60℃),分子量范围在4.6～10 kDa范围内。4.清开灵注射液配液工艺优化。(1)依次加入水牛角珍珠母水解混合液、板蓝根液、栀子液制备四混液,再加到胆酸、猪去氧胆酸的75%乙醇溶液中得六混液,六混液醇沉pH值为7.0,配液pH值为7.5,活性炭灭菌所用活性炭量为0.5%、超滤膜膜孔径为30KD;(2)前后两次充氮时,各成分保留率均在90%以上,清开灵注射液稳定性最好。(3)各中间体在72小时内均稳定。结论:本课题通过不同的分析测试技术,建立了清开灵注射液各原液、中间体及成品中指标成分的定量方法;根据药厂生产具体情况,对清开灵注射液工艺进行优化研究。特别对工艺参数控制水平较低的醇沉工艺和可能引入大分子蛋白并存在安全隐患的水牛角、珍珠母水解工艺,本课题采用多指标正交试验法进行深入,并考察各药浓缩相对密度,为浓缩工艺提供客观评价指标,保障各中间体质量稳定。通过优化消除了清开灵注射液生产工艺控制水平低导致其内在含量差异显著的“瓶颈”制约,为从根源上减少清开灵注射液不良反应的发生,保障其临床应用安全、有效具有重要的意义。