论文部分内容阅读
目的:制备载内皮抑素壳聚糖纳米粒,并对其抗血管和抗肿瘤作用进行研究。方法:利用离子凝胶法制备载内皮抑素壳聚糖纳米粒(ES-NPs),探究负载内皮抑素量的不同对纳米粒粒径、包封率、载药量的影响,选出最佳的制备方案。利用体外透析法,检测ES-NPs的释药特点。并观察ES-NPs在不同温度下血清中的稳定性。利用MTT法和Transwell实验,观察ES-NPs和游离ES对脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁徙的影响。随后建立Lewis肺癌移植瘤模型,随机平均分组,采用PBS、内皮抑素注射液、ES-NPs和空纳米粒对移植瘤进行治疗。每2天测量每只小鼠肿瘤的体积,绘制肿瘤生长曲线。21天观察结束后,计算抑瘤率,收集肿瘤组织和血清,免疫组化法检测各组小鼠移植瘤的微血管密度(MVD),ELISA法检测各组小鼠血清中内皮抑素和VEGF浓度。结果:我们利用离子凝胶法成功制备出负载不同质量内皮抑素的ES-NPs,通过对各批次纳米粒包封率和载药量的比较,我们发现,在40 mL壳聚糖溶液(1 mg/mL)中加入500μL ES(11.2mg/mL)制成的ES-NPs在保证较高包封率的同时也具有合适的载药量和粒径,能满足治疗的需要,并且通过加入5%海藻糖冻干后能够稳定保存。纳米粒外观呈球形,分布均匀,在体外具有明显的缓释性,7d累积释放量达到(60.22±2.58)%,并且在血清中能够稳定存在至少48h。MTT实验显示,ES-NPs对HUVECs的生长有抑制作用。在药物作用的最初24h,ES-NPs对HUVECs的抑制作用与游离ES相差不大(p=0.577)。但随着作用时间的延长,ES-NPs的作用效果明显优于游离ES(p<0.05)。同样,在transwell实验中,ES-NPs对HUVECs的迁徙的抑制作用也要明显强于游离ES,差异具有统计学差异(p<0.05);并且作用时间越长,两者的作用效果的差距越大。在Lewis肺癌移植瘤模型上,我们观察到ES-NPs能明显抑制移植瘤生长。甚至,ES-NPs每7天注射1次的效果都优于游离ES连续注射14天。而ES-NPs连续注射14天在我们的实验中取得了最好的治疗效果,对移植瘤的抑制率高达63.32%。免疫组化CD31染色结果显示,ES-NPs连续注射14天组肿瘤组织的MVD最低,明显低于对照组(p<0.001),游离ES组(p<0.001)。与MVD结果对应,ES-NPs连续注射14天组小鼠血清中的内皮抑素水平明显高于其它各组(p值均<0.05),而VEGF水平明显低于其它各组(p值均<0.05)。证明了ES-NPs主要通过抑制肿瘤血管生成而起到抗肿瘤作用。结论:1)壳聚糖是制备内皮抑素纳米合适的材料,用壳聚糖制备的ES-NPs具有较高的包封率、载药量和明显的缓释性,能满足治疗的需要。2)载内皮抑素壳聚糖纳米粒在体外能明显抑制HUVECs的增殖和迁徙,作用效果优于游离内皮抑素。3)在Lewis肺癌模型上,载内皮抑素壳聚糖纳米粒能增强内皮抑素的治疗作用,通过抑制血管生成而明显抑制肿瘤生长。