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研究目的： 在本项研究中利用组织芯片着重探讨TXNIP在早期乳腺癌患者的表达水平及与其预后的关系。通过体外多种实验方法探讨TXNIP在抗Her-1/Her-2治疗中的表达水平变化，并通过miRNA芯片检测miRNA及相关靶基因在TXNIP与Her-1/Her-2相互作用中的调控机制，旨在发现TXNIP与Her-1/Her-2的相互作用调控乳腺癌细胞增殖的分子机制，为乳腺癌的预防和治疗提供新的分子靶点和治疗策略。 材料、方法与结果： 第一部分TXNIP与Her-1/Her-2信号通路相互作用与乳腺癌总生存期的关系 方法: 1.分析150例乳腺癌组织中TXNIP的表达水平与乳腺癌患者临床病理特征和总生存期(overall survival，OS)的关系。 2.通过免疫组织化学方法检测150例乳腺癌组织和90例癌旁正常组织中TXNIP、p27的表达，并在101例乳腺癌临床标本中进行验证。利用相关统计学方法分析TXNIP、p27与乳腺癌患者OS的关系，以及TXNIP、p27与Her-2状态之间的关系。同时分析TXNIP和p27之间的相关关系。 3.将TXNIP过表达质粒转染到乳腺癌细胞株BT474和SK-BR-3中，采用蛋白印迹法(Western blotting)检测TXNIP及p27的表达水平;用激光共聚焦方法检测p27的核内定位情况。通过流式细胞术观察细胞周期和细胞凋亡情况，并利用克隆形成实验检测TXNIP对细胞增殖的影响。用细胞计数法观察拉帕替尼对转染前后的SK-BR-3细胞增殖情况的影响。 4.用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测Her-1单克隆抗体西妥昔单抗、Her-2单克隆抗体曲妥珠单抗和Her-1/Her-2双重抑制剂拉帕替尼处理后的SK-BR-3和BT474细胞中TXNIP及p27的表达水平。利用双荧光素酶实验检测三种药物对TXNIP转录水平的调控。 5.采用SPSS13.0软件进行统计学分析，两组组间均数的比较用t检验，多组计量资料组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），实验数据以(x)±s进行描述，并进行方差齐性检验。独立组间计数资料比较用卡方检验。相关性分析用r相关分析检验。 结果: 1.在乳腺癌组织芯片样本中，TXNIP的表达水平与乳腺癌患者TNM分期(x2=4.994，P=0.025)呈显著相关，与年龄（x2=2.252，P=0.133）、组织学分级（X2=0.161，P=0.777）、ER状态（x2=0.261，P=0.610）以及PR状态（x2=0.651，P=0.420）未见相关。 2.与癌旁正常组织相比，TXNIP和p27在乳腺组织中的表达水平显著降低(x2=42.633，P＜0.001);x2=9.500，P=0.023)。采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现，在乳腺癌患者中，TXNIP和p27高表达水平预示总生存期延长(x2=6.441，P=0.001;x2=6.276，P=0.012)。利用相关分析发现，在组织芯片中TXNIP、p27与Her-2的表达均呈负相关（r=-0.334，P＜0.001;r=-0.344，P＜0.001）;在101例乳腺癌癌组织标本中，TXNIP、p27与Her-2的表达同样均呈负相关（r=-0.422，P＜0.001;r=-0.284，P=0.004）。 3.Western blotting结果显示在乳腺癌细胞中导入TXNIP，能够增加p27的蛋白表达水平及核内稳定性。流式细胞术发现TXNIP能够增加BT474和SK-BR-3细胞G1期阻滞（依次为t=-5.385，P=0.006; t=-4.778，P=0.009）和凋亡（依次为t=19.906，P＜0.001;t=5.469，P=0.029）。克隆形成实验均提示TXNIP可以抑制BT474和SK-BR-3细胞增殖（t=12.103，P＜0.001;t=12.122，P＜0.001），并且拉帕替尼能够增加TXNIP对细胞的增殖抑制作用(t=5.511，P=0.004)。 4.在西妥昔单抗、曲妥珠单抗和拉帕替尼处理后的BT474细胞中，qRT-PCR显示TXNIP mRNA不同程度升高(t=135.311，P=0.076;t=9.825，P=0.063; t=3.222，P=0.084); p27 mRNA不同程度升高(t=14.269，P=0.056;t=11.135，P=0.089;t=4.860，P=0.040)。双荧光素酶实验显示三种药物均能显著升高BT474细胞的荧光素酶活性（依次为t=41.617，P=0.001;t=26.771，P=0.001;t=93.916，P＜0.001）;SK-BR-3细胞的荧光素酶活性均显著升高（依次为t=18.322，P=0.003;t=12.924，P=0.006; t=9.596，P=0.011）。提示Her-1/Her-2抑制剂能够增加TXNIP的表达水平。 第二部分拉帕替尼介导miR-1470下调c-Jun参与p27的表达调控机制 方法: 1.在0.5μM拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474中，运用qRT-PCR和Western blotting方法检测p27的表达水平;免疫荧光实验检测p27的核内定位情况。 2.在0.5μM拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474中，利用Western blotting检测Her-2信号通路中相关蛋白的表达水平变化。 3.收集不同浓度拉帕替尼处理的乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474，使用miRNA芯片技术检测细胞中miRNA的表达水平，并进行数据汇总和功能聚集分析。运用在线软件TargetScan预测芯片筛选出的差异miRNA的靶基因，并通过在线数据库DAVID对靶基因参与的信号通路进行预测。 4.采用qRT-PCR方法对筛选出miRNA表达进行验证，并用Western blotting检测其对应靶基因的蛋白表达水平。 5.通过在线软件TargetScan预测筛选出的miRNA在相应靶基因3-UTR区的结合位点，构建含此结合位点序列的荧光素酶质粒和筛选出的miRNA过表达质粒。利用双荧光素酶实验、qRT-PCR和Western blotting方法验证筛选出的miRNA对其靶基因的调控作用。并结合流式细胞术检测该miRNA对细胞周期及细胞凋亡的影响。 6.采用SPSS13.0软件进行统计学分析，两组组间均数的比较用t检验，并进行方差齐性检验。多组计量资料组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），实验数据以(x)±s进行描述，并进行方差齐性检验。 结果: 1.qRT-PCR和Western blotting结果显示拉帕替尼处理后的SK-BR-3和BT474细胞中，p27 mRNA的表达水平显著升高(t=21.238，P=0.002;t=24.497，P=0.002)。 3.miRNA芯片结果显示，拉帕替尼可以改变乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的miRNA表达谱。 4.qRT-PCR证明拉帕替尼上调SK-BR-3细胞中miR-1470、miR-126和miR-1208的表达（分别为t=19.118，P=0.003; t=38.645，P=0.001;t=27.411，P=0.001）。 5.利用TargetScan预测得到，miR-1470在c-Jun mRNA的3-UTR端存在一个结合位点。qRT-PCR及Western blotting实验证明miR-1470靶向c-Jun，降低cyclin D1的表达，进而促进p27依赖的SK-BR-3和BT474细胞周期阻滞（t=-4.019，P=0.051;t=-3.572，P=0.003）。 结论与意义： 1.TXNIP在乳腺癌组织中呈低表达，并与Her-2状态呈负相关。TXNIP的表达与乳腺癌患者TNM分期显著相关;TXNIP高表达水平预示总生存期延长。 2.TXNIP可在体外促进乳腺癌细胞的G1期阻滞和细胞凋亡，并抑制细胞的增殖。 3.Her-1/Her-2抑制剂能够在体外增加TXNIP的表达水平。 4.Her-1/Her-2双靶点酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼能在体外增加p27的表达，抑制Her家族下游信号通路Her-2、p-Her-2、p38MAPK、p-p38MAPK、p44/42MAPK、p- p44/42MAPK蛋白的表达水平。 5.miRNA芯片发现拉帕替尼能够上调参与ErbB信号通路的miR-1470、miR-126和miR-1208的表达。其中miR-1470通过靶向c-Jun，促进p27依赖的细胞周期阻滞，抑制乳腺癌细胞的增殖。 6.本实验揭示了TXNIP能够与p27相互作用，进而影响Her-1/Her-2信号通路，在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用，并可能与乳腺癌患者抗Her-1/Her-2治疗相关。