论文部分内容阅读
微生物生长代谢是引起鲜活水产品腐败变质的重要原因之一。波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）具有较高的胺类物质代谢能力,而荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）较强的蛋白水解和生物被膜形成能力,使这两类细菌成为多种冷藏海产鱼类的特定腐败菌（SSO）。水产品特定腐败菌在加工贮藏过程中能够克服多种环境胁迫压力优势生长引起腐败,推测与细菌胁迫应答因子Sigma相关。细菌中RpoS和RpoN蛋白分别为Sigma因子70家族与54家族主要成员,均能在胁迫应激、运动性能、毒力因子分泌等代谢过程中发挥重要调控作用,然而食源性致腐菌Sigma因子报道仍较少。为揭示致腐菌在环境胁迫下生长和代谢,探究RpoS/RpoN蛋白在希瓦氏菌和假单胞菌中的调节作用,研究分析水产致腐菌波罗的海希氏菌和荧光假单胞菌在三类胁迫环境中的生存和生物被膜形成能力,通过自杀性质粒和同源重组无痕敲除RpoS和RpoN蛋白,比较研究生长、被膜形成、运动性、抗胁迫性和致腐性的差异变化,解析希瓦氏菌RpoN在基因转录水平差异以及相关代谢通路。研究为揭示食品微生物致腐机制提供新的理论补充,为水产行业的健康发展夯实基础。主要结果如下:两株希瓦氏菌和两株假单胞菌在培养温度、营养和氧化胁迫条件下生长、生物被膜和蛋白酶活性出现明显变化。10℃、20℃、30℃培养24h易形成生物被膜,4℃生长缓慢,37℃不生长。在稀释1/5LB下生物被膜形成量锐减,而1/10LB基本不生长;在2%或更高浓度葡萄糖培养下生物被膜形成量增加;但1%3%NaCl高渗培养抑制生物被膜形成。4种金属离子Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+浓度与两种致腐菌生长和生物被膜形成密切相关,0.3mmol/L Fe3+、0.3mmol/L Cu2+、1mmol/L Mg2+和10mmol/L Ca2+培养时促进生物被膜形成。希瓦氏菌和假单胞菌在01mg/mL乙酸、00.2%次氯酸钠浓度下生物被膜形成量依次降低,粘附性下降。在3%NaCl和3%葡萄糖胁迫培养时,希瓦氏菌粘附能力无明显变化,假单胞菌在3%NaCl胁迫下菌体粘附量下降,但3%葡萄糖反而刺激粘附能力。同样4株菌在3%葡萄糖促进蛋白酶活力,而3%NaCl酶活力下降。研究发现扩增的希瓦氏菌和假单胞菌RpoS蛋白相似性为86.16%。构建希瓦氏菌和假单胞菌的rpoS基因缺失株（ΔrpoS）,比较两致腐菌野生株与ΔrpoS株的生长、生物被膜、抗胁迫性和致腐能力差异。显示RpoS缺失不影响两种致腐菌的生长及希瓦氏菌的生物被膜,在高葡萄糖、高氯化钠、酸性环境下假单胞菌ΔrpoS显著高于野生株,希瓦氏菌野生株和ΔrpoS无差异。希瓦氏菌ΔrpoS泳动性减弱,鞭毛缩短,但不影响假单胞菌ΔrpoS的泳动。在灭菌鱼汁中希瓦氏菌ΔrpoS株三甲胺（TMA）含量减少,胞外多糖（EPS）生成增加,不影响蛋白酶和TVB-N含量,假单胞菌ΔrpoS株蛋白酶和EPS形成也增加。在30%NaCl、10%乙醇、45℃、10mmol/L过氧化氢、0.001%次氯酸钠、150μg/mL结晶紫胁迫环境中希瓦氏菌野生株的存活率分别是ΔrpoS的1.25、2.42、4.55、1.76、8.32和3.62倍,而假单胞菌野生株是ΔrpoS株的1.01、9.00、1.11、8.80、1.26和1.31倍,RpoS蛋白显著增强两种菌的抗高盐、热和氧化胁迫能力（P<0.05）。相似地,分析希瓦氏菌和假单胞菌RpoN蛋白的相似性为86.24%。构建了希瓦氏菌和假单胞菌rpoN基因缺失株（ΔrpoN）,比较野生株和ΔrpoN生长、生物被膜、抗胁迫性、耐药性和致腐能力的差异。结果显示,希瓦氏菌和假单胞菌ΔrpoN株延缓生长速度,不影响细菌数量。ΔrpoN在培养前24h被膜低于野生株,而36h后高于野生株,表明RpoN缺失也减慢生物被膜的发展,而高氯化钠和酸性环境抑制两种致腐菌ΔrpoN被膜形成。希瓦氏菌和假单胞菌ΔrpoN几乎丧失泳动性,透射电镜观察发现两株ΔrpoN无鞭毛结构。希瓦氏菌ΔrpoN除30%NaCl和10mmol/L过氧化氢处理外,10%乙醇、45℃、0.001%次氯酸钠和150μg/mL结晶紫处理后存活率显著减少（P<0.05）,而假单胞菌ΔrpoN株仅在过氧化氢和次氯酸钠处理时存活率明显下降。另外,假单胞菌比希瓦氏菌野生株耐药性更强,在测试的19种抗生素中希瓦氏菌ΔrpoN株降低18种抗生素耐药性,而假单胞菌ΔrpoN减弱15种抗生素耐药性（P<0.05）。并且,两种致腐菌ΔrpoN的群体感应活性显著降低,其中希瓦氏菌ΔrpoN中与致腐调控相关的cyclo-（L-Pro-L-Leu）和cyclo-（L-Pro-L-Phe）两种DKPs分泌显著降低,假单胞菌ΔrpoN中AHLs活性明显减少,特别是C4-HSL,从而干扰细菌群体感应调控功能。转录组学测序分析希瓦氏菌在转录水平RpoN蛋白调控基因和主要代谢通路。结果显示,希瓦氏菌中鞭毛组装相关14个基因都下调,与ΔrpoN株运动丧失一致;多个参与碳、氮代谢途径基因出现下调,特别是希瓦氏菌参与胺类物质代谢酶表达下降。缺失株ΔrpoN中与生物被膜、耐药性、群体感应、蛋白酶等相关基因出现下调,与前期表型研究结果较一致。荧光定量PCR验证希瓦氏菌转录组学可靠性,也显示假单胞菌ΔrpoN中运动、被膜、蛋白酶相关基因下调,与表型结果一致。综上,波罗的海希瓦氏菌和荧光假单胞菌RpoS/RpoN蛋白影响生物被膜、胁迫性和致腐能力,而两个Sigma因子调控致腐菌的功能存在差异。RpoS蛋白主要参与氧化、酸性等应激环境应答,部分参与细菌致腐性能和运动性,不影响菌体生长和生物被膜形成。而RpoN蛋白主要负责调控致腐菌中鞭毛组装、碳氮代谢、被膜形成和群体感应,部分影响抗应激反应和耐药性。RpoS和RpoN调控希瓦氏菌和假单胞菌生理功能略有差异,其中RpoN主要参与细胞生物膜合成、氧化磷酸化酶合成运输、鞭毛着生等,RpoS主要负责应激过程相关酶的合成代谢,维持细胞内正常渗透平衡。