目的及意义肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）为我国原发性肝癌中最常见的一种细胞类型，死亡率高，生存期短。早期发现、早期诊断HCC并推测其恶性程度及对预后进行判断，是当前亟待解决的问题。CT灌注成像（CT Perfusion，CTP）作为一种新的检查手段，不仅能发现组织器官的形态学变化，而且能通过灌注成像测量局部组织血液灌注，了解其血流动力学变化，早期发现其功能改变，反映脏器生理及病理的改变。64排螺旋CT的临床应用，成功实现了肝脏的CT灌注成像检查，可快速、准确、无创地评价肝脏微循环的血流动力学变化并应用于临床，显示了广阔的临床应用前景。本研究利用64排螺旋CT对兔VX₂肝癌模型和临床病例进行肝脏CT灌注成像重点研究以下内容，（1）探讨CT灌注成像的技术优势；（2）肝细胞癌灌注图像及灌注参数分析和评价，探讨病变内部的血流灌注特点；（3）结合病理对照，进一步探讨肝癌灌注参数与肿瘤血管生成的相关性，以期获得在活体中无创、有效评价肿瘤的血管生成状况，从而为临床提供有意义的指导。资料与方法1、仪器设备采用荷兰PHILIPS Brilliance 64排螺旋CT，美国MEDRAD双筒高压注射器。图像后处理为自带肝脏专用灌注软件和Mxview工作站。2、动物实验及临床研究对象2．1动物实验资料：2．1．1实验动物分组：新西兰大白兔18只，体重2-3kg，雌雄不限，由广东省医学实验动物中心提供。随机将实验动物分为实验组和对照组，实验组共三组，每组5只，对照组共三组，每组1只。2．1．2接种用VX₂细胞株及兔VX₂肝癌模型的制备：荷瘤VX₂新西兰种兔1只，将瘤细胞接种于兔大腿部皮下成瘤并传代，选取2周左右种兔切除肿瘤，在平皿上制成1-2mm大小碎块，用18G针头针筒抽吸作为瘤种备用，采用直接包埋种瘤法。20％乌拉坦（5ml／kg），经试验兔耳缘静脉缓慢静推麻醉。兔子仰卧位固定于动物实验台上，术区备皮，常规消毒铺巾后，在剑突下取正中切口，逐层剪开皮肤、皮下组织、肌肉及腹膜进入腹腔，暴露兔肝脏，找到左、中叶，距其下缘约1．0-1．5cm处刺破肝实质表面约0．5cm，形成楔形小缺损，将一小块肿瘤组织沿小缺损处植入肝内，确认肿瘤组织在肝实质内后，用明胶海绵压迫止血，以防止肿瘤组织随血溢出造成腹腔种植。止血后将肝送回腹腔，切口内逐层喷洒抗菌素液后缝合。待种植兔复苏，送回动物房继续饲养。2．1．3实验动物的处理：实验组新西兰大白兔植入肿瘤后14d、18d、22d，将实验组兔及对照组兔麻醉，固定于CT扫描床上行灌注成像；扫描完毕后，采用空气栓塞法处死实验动物，进行大体病理结果和免疫组化VEGF的量化结果与CTP灌注成像结果的对照分析。2．2临床研究资料搜集15例手术切除并经病理诊断为肝细胞癌（HCC）的患者，患者年龄34～76岁，平均45岁，其中男11例，女4例，术前行CT灌注成像检查，术后病理行常规HE及免疫组织化学（MVD、VEGF）检查。每一病理标本分别选取癌灶和癌旁肝组织（距癌灶边缘2cm以上）两个部位取材进行对照。3、CT扫描方案及参数3．1动物实验组CT扫描方案检查当日禁食12h，扫描前于兔耳缘静脉插入静脉留置针（24GA×0．75IN）。将兔麻醉后仰卧位固定于木板上，扎腹带减少呼吸运动，先行常规全肝平扫，确定病灶及感兴趣区的范围及层面，应用静态同层动态扫描灌注模式，用双筒高压注射器以1．5ml／s速度注入对比剂碘必乐（370mg／ml）4ml，以同样速率注入生理盐水2ml，自对比剂注入后延迟1s开始扫描，采用连续扫描模式采集图像。扫描参数：探测器排列6×0．625mm，层厚2．5mm，非螺旋扫描，120KV，80mAs，360度旋转时间：1．2s，每转扫描时间0．75s，扫描50次，扫描总时间60s。3．2临床病例组CT扫描方案患者空腹，于肘前静脉留置20G的静脉套管针，扫描前10分钟口服清水500ml，扫描时加用腹带，扫描过程嘱患者平静呼吸。先行上腹部平扫，确定肝脏范围，应用全肝灌注模式，用双筒高压注射器以5ml／s速度注入对比剂典必乐（370mgI／ml）40ml，以同样速率注入生理盐水20ml，于注入对比剂后8s开始全肝灌注扫描。扫描参数主要有：探测器排列64×0．625mm，层厚5．0mm，间距5．0mm，Pitch1．165，120KV，100mAs，360度旋转时间：0．4s，扫描间隔时间4．7～5．6s（默认最小），共扫描15次，控制在85～95秒之间，获得对比剂在肝脏循环完整的动态曲线。3．3 CT灌注成像方法3．3．1图像传输处理将两组CT灌注扫描所得一系列图像传输到Mxview后处理工作站上，导入肝脏CT灌注软件（CT perfusion，CTP），腹主动脉代替肝动脉被确定为输入动脉，门静脉主干或主要分支被确定为输入门静脉，进行图像后处理。3．3．2兴趣区（region of interest，ROI）的选择根据不同的目的选定兴趣区（ROI），一般包括主动脉、门静脉、肝脏、脾脏等。主动脉和门静脉可为圆形或环形，实质器官（肝、脾）可为不规则形。ROI尽可能大，不小于50个像素，以减少量子噪声，但不能达到器官的边缘以避免部分容积效应的影响，实质区ROI尽量不包括大血管，病灶则避开坏死区。3．3．3时间-密度曲线（time density curve，TDC）选择好合适的ROI后，灌注软件自动生成TDC，包括主动脉、门静脉、肝脏、脾等的TDC，观察所得TDC的走行趋势。3．3．4计算方法和主要灌注参数本软件利用去卷积模型法，计算出的肝脏CT灌注成像的主要参数有：肝动脉灌注量（HAP）、门静脉灌注量（HPP）、全肝总灌注量（TLP）、肝动脉灌注指数（HPI）等。肝动脉灌注指数（HPI）计算公式：HPI=HAP／（HAP+HPP）×100％，而TLP=HAP+HPP3．3．5灌注彩图的生成利用CT灌注软件，以脾强化峰值时间为界，将肝实质灌注分为肝动脉期和门静脉期，对获得的参数进行图像重组和伪彩染色处理，得到血流灌注彩图，共分四种显示，即肝动脉血流灌注图、门静脉血流灌注图、总血流灌注图及肝动脉血流灌注指数图，以此来全面评价组织器官的灌注状态。4、病理学评价4．1临床病例组MVD计算方法参照Weidner等的判断标准，任何被CD34抗体染成棕黄色孤立的内皮细胞或内皮细胞簇团，只要与邻近微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就把它们作为一个微血管；只要结构不相连，其分支结构也作为一个微血管计数，分辨不清或染色模糊的细胞、肌层较厚或管腔面积>8个血红细胞直径的血管不计数。首先在100倍镜下浏览全片，寻找肿瘤血管高密度区，选定4个高密度血管区，200倍镜下观察，在目镜网格测微尺0．25μm²范围内计数，将4个视野血管数目取平均值为MVD。4．2 VEGF染色结果评价方法VEGF表达结果的判断采用兼顾VEGF阳性染色的强度和阳性细胞所占的百分比的判断标准。VEGF阳性结果判定：VEGF阳性表达定位于肿瘤细胞胞浆中，阳性细胞显示棕黄色或棕褐色颗粒样分布，整个切片观察3个高倍镜视野，计数1000个肿瘤细胞，阳性细胞记数=10％即定位阴性，评定为0；阳性细胞记数=10％即定位阳性，阳性细胞记数占总细胞数10％-25％评定为1；26％-50％评定为2；51％-75％评定为3；76％-100％评定为4；简化填表为0；1；2；3；4。5、统计学分析采用SPSS13．0统计软件包进行统计学处理，对CT灌注参数、MVD等计数资料用（?）±s表示。对两样本采用两样本独立t检验；多个样本则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较LSD法；对等级资料VEGF进行量化处理，并采用多样本的非参数检验；CT灌注参数HAP和MVD及VEGF的相关分析分别采用Pearson相关分析和Spearman’s相关分析法，所有统计处理均以P<0．05认为有统计学差异。结果1、动物实验结果1．1正常对照组形态学观察及HE、免疫组化光镜分析结果对照组3只实验兔肝脏均未见肿瘤及其它异常病理改变，HE光镜下见：肝细胞排列规则，边界清楚，形态规则，呈典型的小叶结构，肝细胞大小均匀，围绕小叶中央静脉呈放射状排列，可见明显的肝窦结构；细胞核大小及形态规则，染色均匀，无核分裂像。正常对照组VEGF的光镜分析结果：正常肝组织中无阳性细胞，均呈阴性表现。1．2兔VX₂肝癌模型的形态学观察及HE、免疫组化光镜分析结果实验组15只新西兰大白兔均成功长出肿瘤。在第14d、18d、22d动态测量共计26个瘤灶，分别为4个、11个、6个、5个瘤灶；大小范围为0．3cm-3．9cm，所测瘤灶位于肝左叶16个，肝右叶10个，实验组兔肝脏的瘤灶表现为单发9只，多发6只。光学低倍镜下见：肿瘤细胞在肝内呈浸润性癌巢，与肝实质无明显边界，间质分界不清，结缔组织多少不等，癌巢边缘见浸润状肝索结构；肿瘤细胞分散排列，可见纤维间隔，新生毛细血管丰富；高倍镜下可见瘤细胞体积大，形态不规则，细胞呈不规则排列，胞浆丰富，淡红染色，核肥大，其大小及形态各异，染色浓淡不均，核分裂像多见，间质内可见淋巴细胞、浆细胞浸润。VEGF的阳性着色多见于细胞质内，呈均匀或不均匀的颗粒状、团块状，呈棕褐色；随着癌细胞增生活跃，阳性细胞丰富，数量也增多，且染色增强。1．3实验组CT灌注结果及其与病理的关系1．3．1实验组和对照组CT灌注参数分析实验组CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：59．15±16．49、92．07±31．96、39．90±6．82；对照组CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：32．38±8．48、148．54±41．23、18．46±5．66。经两独立样本t检验，实验组和对照组CT灌注参数HAP（t=-6．690）、HPP（t=5．169）、HPI（t=-12．074）的P=0．000，有显著性差异。1．3．2实验组不同时间段CT灌注参数对照分析14d、18d、22d试验组，每组5只兔VX₂肝癌模型，各选取ROI测量3次，14d组CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：42．03±22．32、113．30±13．99、25．90±11．02；18d组CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：48．76±17．04、59．41±15．04、44．34±9．90；22d组CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：65．99±15．96、23．78±11．18、73．33±11．04。经单因素方差分析，实验组不同时间段CT灌注参数HAP（F=6．543）、HPP（F=167．919）、HPI（F=75．029）的P=0．000，有显著性差异。1．3．3实验组不同部位CT灌注参数对照表兔VX₂肝癌模型病灶常发生坏死，为保证测量结果的准确，我们选取肿瘤生长活跃而又很少有坏死的瘤灶边缘作为感兴趣区进行灌注参数的测量。本文同时对实验组肝癌边缘区及瘤旁肝组织的灌注参数值进行了对比分析。肿瘤边缘区CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：53．89±20．15、66．62±43．96、48．45±18．56；区CT灌注参数HAP、HPP、HPI分别为：27．35±11．17、132．08±21．87、17．12±6．74。经两独立样本t检验，实验组不同部位CT灌注参数HAP（t=-7．360）、HPP（t=8．596）、HPI（t=-10．439）的P=0．000，有显著性差异。1．3．4 VEGF病理对照分析兔VX₂肝癌模型的瘤灶组织VEGF变化，14d、18d、22d分别为：1．00±0．38，1．47±0．64，2．07±0．88；对照组为0．13±0．35。经多重比较LSD检验，除14d与18d、18d与22d无统计学意义外，余均有显著性差异（P<0．05）。实验组兔肝癌与对照组兔肝脏组织VEGF的F=27．39，P=0．000，也有统计学意义。实验组兔肝癌CT灌注参数HAP、HPI与VEGF经pearson相关分析表明，HAP与VEGF存在正相关（r=0．610，P=0．000）；HPI与VEGF也存在正相关（r=0．636，P=0．000），有统计学意义。2、临床研究结果2．1免疫组化（MVD、VEGF）光镜分析结果肝癌及癌旁组织中CD34均有表达，但肝癌组织的MVD显著高于癌旁肝组织。切片中肝癌血窦内皮细胞均见不同程度的黄染，癌旁可见个别血管染色。VEGF主要表达于肿瘤细胞胞浆中，阳性着色呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒状；部分标本癌旁肝组织中可有少量表达。VEGF阳性的肿瘤细胞分布不均，肿瘤细胞浸润区域着色程度较强，为弥漫性或集中表达于癌巢，靠近肿瘤边缘或包膜处阳性癌巢较多，VEGF表达较强。肝癌组中VEGF染色强度明显高于癌旁肝组织，15例肝癌组织中VEGF表达阳性者14例，15例癌旁肝组织中VEGF表达阳性者仅2例。肝癌及癌旁肝组织中CD34均有表达，切片中肝癌血窦内皮细胞均见不同程度的黄染，癌旁可见个别血管染色。2．3统计学分析2．3．1肝癌组织中的CD34表达为50．40±12．56；癌旁肝组织中的CD34的表达13．73±5．53。经两独立样本t检验，两组之间有统计学差异P<0．05。2．3．2肝癌和癌旁肝组织中的VEGF表达肝癌组织中VEGF表达阴性1例，阳性14例，其中4例呈强阳性；癌旁肝组织中VEGF表达阴性13例，弱阳性2例。两组经非参数Mann-whitney检验P<0．05，有统计学意义。2．3．3 VEGF的表达与MVD之间的相关性分析VEGF表达阳性的肝癌病人的MVD值明显高于VEGF表达阴性者，VEGF在肝癌组织中的表达数量和强度高于癌旁肝组织，而肝癌组织MVD也高于癌旁肝组织，经Spearman’s秩和相关分析VEGF表达和MVD之间呈正相关（r=0．889，P=0．000）2．3．4肝癌和癌旁肝组织CT灌注参数及HAP与VEGF、MVD的相关性肝癌组织灌注参数HAP、HPP、HPI分别为41．72±9．97、24．37±7．34、58．78±15．32；癌旁肝组织灌注参数HAP、HPP、HPI分别为24．3±15．7、54．10±19．06、30．03±15．77，肝癌和癌旁肝组织灌注参数经两样本独立t检验，HAP、HPP、HPI有显著性差异（P<0．05）。肝癌组织灌注参数HAP与MVD间经Pearson相关分析，呈正相关（r=0．664，P=0．000）；肝癌组织灌注参数HAP与VEGF表达程度经Spearman’s相关分析，呈正相关（r=0．633，P=0．000），有统计学意义。结论1、动物实验研究的结论1．1兔VX₂肝癌模型采用直接包埋植法，成瘤时间较短，成瘤率高。瘤块在2～3周体积增长稳定，且坏死不明显，是实施CT灌注成像的最佳时期。1．2 CT灌注成像在观察兔VX₂肝癌模型的血液动力学改变方面具有优越性和准确性，可以提供肝动脉和门静脉灌注的量化信息。1．3兔肝VX₂瘤CT灌注参数HAP、HPI与血管生成指标VEGF的表达存在正相关，说明CT灌注参数一定程度上可间接反映肿瘤的血管生成。2、临床应用研究的结论2．1 64排螺旋CT全肝灌注成像模式克服以往灌注成像模式扫描范围窄、受呼吸运动限制较大等缺点，简单实用，具有全脏器灌注成像的优势。2．2肝癌组织的MVD及VEGF表达均高于癌旁肝组织，统计学上有意义。2．3注参数HAP和MVD与VEGF表达存在正相关，从而说明CT灌注成像与肿瘤血管的生成存在相关性，因而CT灌注成像可用于活体上评价肝癌的血管生成程度。