慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)均为B细胞来源的恶性肿瘤,以凋亡缺陷和增殖异常为特征。近年来随着新型药物的应用,CLL和MCL病人的长期生存得到改善。然而,药物耐药仍然是疾病治疗中一个不可逾越的障碍。CLL目前仍然是一种除通过造血干细胞移植治疗以外无法达到治愈目的的疾病。该病以成熟样B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏大量蓄积为特征,病程长短不一,诊断后生存期在数月至十余年之间。免疫球蛋白重链可变区基因(IGHV)、运动失调性毛细血管扩张症基因(ATM)和TP53肿瘤抑制基因等基因突变状态、β2微球蛋白和zeta链相关蛋白激酶70(ZAP70)的异常表达、有丝分裂间期细胞遗传学异常以及中期复杂核型等特征可为该病的诊断、治疗和预后判断提供重要依据。MCL是一种具有独特形态学特征的侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)亚型,以染色体出现t(11；14)(q13；q32)易位导致cyclin D1的过表达为特征。MCL约占成人NHL的3-10%并经常发生传统化疗药物耐药。MCL病人的中位生存期仅为3-5年。因此,目前CLL和MCL病人的临床治疗亟需新的方法和突破。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一类对染色体的结构构象和多种关键蛋白质的翻译后修饰发挥着重要调控作用的蛋白酶。HDACs在基因转录调控过程中发挥着关键作用,同时亦与恶性肿瘤的发病机制有关。HDAC抑制剂作为一类新出现的抗肿瘤药物,可以通过调控一系列的蛋白底物乙酰化水平、损伤线粒体功能从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。目前,已有多项研究显示泛HDAC抑制剂伏力诺他(vorinostat,简称为SAHA)和帕比司他(panobinostat,简称为LBH589)在体外对CLL和MCL细胞具有强力的细胞毒性作用。然而,在CLL和MCL病人中应用此类抑制剂却并没有显现出显著的单药活性。虽然增加药物剂量可以提升治疗效果,但是由于SAHA和LBH589较低的药物作用特异性,诸多令人不希望发生的副反应,比如血液系统、肝脏和胃肠道毒性等亦随之而来。目前研究认为,包括CLL和MCL细胞凋亡信号通路内源性缺陷、肿瘤细胞与骨髓微环境中的基质细胞和免疫细胞之间的相互作用在内的多重因素参与了肿瘤耐药的发生。骨髓基质细胞(BMSCs)和免疫细胞表达和分泌的多种细胞因子、趋化因子等活性分子与肿瘤细胞的生存、增殖和转移密切相关。由骨髓基质细胞所分泌的多种细胞因子和趋化因子,如白介素1β (IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素11(IL-11)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和基质细胞衍生因子-1(SDF-1,亦称为CXCL12)可以直接或间接激活信号转导和转录活化蛋白3(STAT3)信号通路。早前已有多项研究揭示IL-6和STAT3在包括CLL和MCL在内的多种的人类肿瘤中作为致瘤因素参与肿瘤的发生与发展。WP1066是一种小分子STAT3抑制剂,对急性髓系白血病、真性红细胞增多症、黑色素瘤、恶性神经胶质细胞瘤和肾细胞癌等肿瘤细胞具有显著的生长抑制作用。WP1066可通过抑制STAT3的激活、下调STAT3上游Janus激酶(JAKs)的活性阻断JAK/STAT3信号通路。目前,尚无关于联合应用WP1066与HDAC抑制剂治疗CLL和MCL的研究报道。本研究通过应用细胞生物学和分子生物学等多种研究技术,评估WP1066联合HDAC抑制剂对CLL和MCL细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,并探讨相关作用机制,阐明STAT3信号通路在诱导CLL和MCL细胞发生HDAC抑制剂耐药中的作用。第一部分：STAT3信号通路介导慢性淋巴细胞白血病细胞发生组蛋白去乙酰化酶抑制剂耐药的机制研究目的：本研究旨在阐明STAT3信号通路在CLL细胞发生SAHA和LBH589耐药中的作用及其机制；并对体外联合应用SAHA或LBH589与新型小分子STAT3靶向抑制剂WP1066的促凋亡活性进行评估,为寻求一种提高HDAC抑制剂对CLL病人疗效的有效途径提供理论依据。材料与方法：1.标本收集和外周血单个核细胞(PBMCs)分离；2.细胞培养和骨髓基质细胞层的建立；3.采用CCK-8法检测药物的细胞毒性；4.采用Annexin V/7-aminoactinomycin D (7-AAD)双染法进行细胞凋亡分析；5.蛋白提取和western blot分析；6.罗丹明123(Rho123)外排试验；7.RNA抽提、逆转录和实时定量PCR；8.统计学分析。结果：1. HDAC抑制剂对IL-6诱导的CLL细胞STAT3 Tyr705残基磷酸化水平具有调节作用,并可显著提高STAT3 Lys685残基乙酰化水平在33例CLL原代细胞样本中,28例(85%)未检测到STAT3 Tyr705残基发生持续磷酸化。在IL-6加入前,采用20μM SAHA或100nM LBH589预处理CLL细胞4小时,可以完全抑制IL-6诱导的STAT3 Tyr705残基磷酸化。然而,采用较低浓度的SAHA或LHB589(比如1μM SAHA或lOnM LBH589)预处理CLL细胞后,则导致IL-6诱导的STAT3磷酸化水平进一步上调。2.5μM和10μM的SAHA均可显著提高STAT3 Lys685残基乙酰化水平。2. SAHA促进IL-6诱导的Mcl-1和Bcl-xL蛋白上调lOng/mL IL-6处理CLL细胞24小时可导致抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xL表达水平较原有水平升高1倍,然而Bcl-2蛋白水平无明显变化。2.5μM SAHA与IL-6共处理CLL细胞24小时可进一步促进IL-6诱导的MCL1、Bcl-XL蛋白的表达升高,但对Bcl-2蛋白表达亦无明显影响。3.IL-6可诱导CLL细胞发生HDAC抑制剂耐药,WP1066可逆转该耐药的发生IL-6降低CLL细胞对SAHA和LBH589的敏感度,导致药物抑制CLL细胞生长的平均半数抑制浓度(IC50)升高(P<0.01)。Annexin V-PE/7-AAD双染流式分析显示IL-6可抑制SAHA或LHB589诱导的CLL细胞凋亡,而WP1066则可拮抗该凋亡抑制作用。Western blot分析结果显示IL-6可以完全抑制SAHA或LBH589引起的多聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(PARP)蛋白断裂；联合应用WP1066不但可以促进HDAC抑制剂引起的PARP蛋白断裂,而且对IL-6介导的PARP蛋白断裂减少具有拮抗作用。4.WP1066可以有效拮抗IL-6诱导的STAT3磷酸化,但对耐药CLL细胞株MEC-1缺乏促凋亡活性,对多药耐药基因的转录及多药耐药相关蛋白的功能亦无明显影响在原代CLL细胞中WP1066单药IC50范围为自3.28μM到大于20μM(n=10),中位值为5.93μM。Caspase蛋白活化分析显示,WP1066对人p53 deleted/mutated CLL细胞株MEC-1仅有微弱的凋亡诱导作用。Rho123外排试验显示5μM WP1066仅能导致MEC-1细胞Rho123潴留率增加16.87±5.69%,用10μM WP1066处理MEC-1细胞后该值升高至36.57±7.29%。此外,WP1066对MEC-1细胞多药耐药基因mRNA表达亦无显著影响。5. SAHA与WP1066联合应用对STAT3信号通路具有调控作用Western blot分析显示,无论SAHA存在与否,WP1066均可显著抑制IL-6诱导的STAT3活化。WP1066单药或与2.5μM SAHA联合应用均可导致Mcl-1和Bcl-xL蛋白表达发生轻微下调,然而对Bcl-2蛋白表达无明显影响。此外,无论SAHA干预与否,WP1066均可显著逆转IL-6诱导的Mcl-1和Bcl-xL蛋白表达上调。6.WP1066逆转原代CLL细胞与BMSCs共培养所诱导的CLL细胞HDAC抑制剂耐药与BMSC细胞层共培养可以保护原代CLL细胞免于发生HDAC抑制剂诱导的凋亡。同时,与BMSCs共培养还可导致原代CLL细胞STAT3活化。采用低浓度的SAHA或LBH589预处理原代CLL细胞后,经过与BMSCs共培养,可以导致STAT3磷酸化水平发生显著上调。而当采用10μM SAHA或100nM LBH589预处理CLL细胞后,则可抑制CLL细胞与BMSCs共培养导致的CLL细胞STAT3磷酸化。WP1066不但可以抑制CLL细胞与BMSCs共培养所致的CLL细胞STAT3活化,而且可以促进SAHA或LBH589预处理所致的PARP断裂增加。Annexin V/7-AAD双染流式分析结果亦显示WP1066可以逆转CLL细胞与BMSCs共培养所诱导的CLL细胞HDAC抑制剂耐药。结论：本研究证实了IL-6或与BMSCs共培养可以保护原代CLL细胞免于发生HDAC抑制剂引起的细胞凋亡。这种保护作用可能由STAT3信号通路的激活所介导,而WP1066可以有效逆转该细胞保护作用。我们的研究提示通过靶向阻断STAT3信号通路,阻断CLL肿瘤微环境所提供的抗凋亡信号,或许能够成为一种提高HDAC抑制剂对CLL病人疗效的有效途径。第二部分：WP1066联合伏力诺他诱导套细胞淋巴瘤细胞发生凋亡的机制研究目的：评估WP1066联合伏力诺他(SAHA)对MCL细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,并探讨相关作用机制。材料与方法：1.细胞培养；2.采用CCK-8法检测药物的细胞毒性；3.采用Annexin V/7-AAD双染法进行细胞凋亡分析；4.RNA抽提、逆转录和实时定量PCR；5.蛋白提取和western blot分析；6.统计学分析。结果：1.WP1066和SAHA对多种MCL细胞具有显著的生长抑制作用单药处理MCL细胞株48小时,WP1066对Mino、SP53、Granta 519和Jeko-1细胞的IC50浓度分别为4.71μM、6031μM、11.86μM和大于20μM；相应的,SAHA对以上四种MCL细胞株的IC50浓度分别为2.64μM、7.73μM、10.49μM和2.Z5μM。Western blot分析显示Tyr705残基磷酸化STAT3 (p-STAT3)在Granta 519和SP53细胞株中呈高表达,在Mino细胞株中呈低表达,在Jeko-1细胞株中表达呈阴性。2.WP1066协同SAHA抑制MCL细胞株的生长5μM WP1066与5μM SAHA联合应用较任一单药应用均显著抑制Granta 519和SP53细胞株的生长,且该抑制作用在72小时内呈时间依赖性。经WP1066处理Granta 519和SP53细胞株24小时后研究结果显示WP1066对p-STAT3表达呈浓度依赖性抑制。联合应用WP1066与SAHA分别处理四种MCL细胞株,其药物联合作用指数(CI)最低值均小于0.5,证实两药联用具有较高的协同抗肿瘤效应。3.WP1066联合SAHA可抑制STAT3活化并诱导MCL细胞发生半胱天冬酶(caspase)依赖性凋亡Annexin V/7-AAD试验显示WP1066和SAHA单药处理均可诱导Granta 519和SP53细胞发生凋亡,并且两药联合应用可显著提升细胞凋亡率(P<0.01)。Western Blot分析表明WP1066不但可以抑制STAT3的活化,进一步促进SAHA诱导的caspase-3前体蛋白表达下调,而且显著促进caspase-3下游底物PARP蛋白的分裂。4.WP1066与SAHA联合应用可调控多种凋亡相关基因的mRNA表达经5μM SAHA单药或联合5μM WP1066处理24小时可以诱导Granta 519细胞p21cip1和Bax基因mRNA发生显著上调,并降低c-Myc和cyclin D1基因的表达；但对Bcl-2基因mRNA的表达没有明显影响。在SP53细胞株中亦观察到与Granta 519细胞株相似的结果。结论：本研究证实体外联合应用STAT3抑制剂WP1066与HDAC抑制剂SAHA处理MCL细胞株具有协同抗肿瘤效应；其潜在药物协同机制与药物的联合应用可以促进MCL细胞STAT3磷酸化组成性表达的下调、调控抗凋亡和促凋亡相关基因的表达以及诱导肿瘤细胞发生caspase依赖性凋亡密切相关。我们的研究结果提示,通过拮抗STAT3信号通路异常激活,包括WP1066在内的STAT3选择性抑制剂可以作为佐剂逆转MCL细胞耐药发生,为MCL的治疗开辟新的途径。