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研究背景与目的:胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)按其所发生部位的不同可分为肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)、肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)以及远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)。近年来胆管癌在全球范围内发病率和死亡率呈现逐渐升高的趋势。由于其发病隐匿、发展迅速、恶性程度高以及早期易发生侵袭与转移等特点,一半以上的患者确诊时已是晚期。手术切除被认为是CCA最主要的治疗手段,但即使根治性手术切除的患者5年生存率也仅为20%～40%。因此,找到更有效的胆管癌治疗靶点是至关重要的。胆管癌富含大量基质细胞成分,其中存在一群具有分泌能力的成纤维细胞,被称为“癌相关成纤维细胞”(cancer-associated fibroblasts,CAFs)。CAFs能影响胆管癌的各种生物学行为。Podoplanin是一种大小为38-kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白,被认为是淋巴管内皮细胞特异性标志物。最近的研究发现,podoplanin在有些恶性肿瘤细胞和CAFs中表达,并与患者的预后有相关性,但其具体的机制尚不清楚。已有研究发现,podoplanin在细胞中的表达可以增强细胞迁移和侵袭能力。Podoplanin 的表达能够介导上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT),进而引起肿瘤的侵袭转移。此外,podoplanin通过改变Rho家族中的小GTP酶的活性来影响肿瘤迁移与侵袭能力。目前,关于podoplanin在胆管癌组织中的表达与其作用的研究甚少。研究podoplanin在胆管癌中的分子机理,有利于我们找到胆管癌新型生物标志和潜在的治疗靶点。材料与方法:1.从南京大学医学院附属鼓楼医院病理科获取66例ICC患者与42例pCCA患者的石蜡组织,所有的组织标本包括癌和癌旁,对podoplanin进行免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC),并与胆管癌患者临床病理特征进行统计学分析。2.从裸鼠皮下种植瘤模型中分离出CAFs,并通过细胞双重免疫荧光与流式细胞学的方法进行鉴定。用podoplanin基因过表达的腺病毒(Adenovirus mediated podoplanin gene,Ad-podoplanin)和空载腺病毒(Adenovirus vector,Ad-vector)转染原代培养的CAFs。通过CCK-8细胞增殖实验和Transwell迁移实验检测podoplanin过表达对CAFs增殖与迁移能力的影响。通过Western Blot检测ERM、Cofilin和MLC-2等蛋白的表达水平。成管实验用于检测Ad-podoplanin CAFs对人真皮淋巴管内皮细胞(Human dermal lymphatic endothelial cells,HDLECs)的成管能力。通过Transwell侵袭实验分析Ad-podoplanin CAFs对胆管癌细胞系QBC939侵袭能力的影响。通过裸鼠致瘤实验评估Ad-podoplanin CAFs对胆管癌细胞致瘤能力的影响(这个实验包括QBC939、QBC939+Ad-Vector CAFs和QBC939+Ad-podoplanin CAFs 等三个组)。3.Podoplanin过表达对QBC939细胞侵袭和转移能力的影响通过Transwell侵袭实验和小鼠肝转移模型来检测。用Ad-podoplanin对两种胆管癌细胞系QBC939和HCCC9810进行podoplanin基因的过表达。再通过Western Blot检测胆管癌细胞系中podoplanin过表达对EMT相关蛋白表达的影响和Rho GTP家族中的Rho A、Cdc42和Rac1等蛋白活性的影响。研究结果:1.42例pCCA患者免疫组化结果显示,CAFs中podoplanin 阳性表达的癌旁组织比例为8/42,并且都是弱或中等程度的表达;与此相反,在癌组织中,CAFs中podoplanin强阳性的比例为20/42,而且podoplanin在CAFs中的表达与TNM分期(P=0.002)和淋巴结转移(P=0.014)有关;类似地,在ICC中podoplanin阳性CAFs 比例为29/66,癌旁组织中则13/66,并9例为弱表达,同时podoplanin在CAFs中的表达与ICC患者神经侵犯(P=0.011)和淋巴结转移(P=0.045)程度具有相关性;Kaplan-Meier生存分析结果也显示,在ICC和pCCA中,podoplanin阳性的CAFs组表现出更低的生存趋势,log rank检验结果分别为P=0.018和P=0.042;因此,可认为胆管癌中podoplanin在CAFs中的表达情况是反映胆管癌患者预后不良的指标。在pCCA组织中,Podoplanin在肿瘤细胞中的表达与pCCA患者临床病理特征以及生存率都没有明确的相关性;而在ICC组织中,podoplanin在肿瘤细胞中的表达与患者TNM分期(P<0.01)与淋巴结转移(P=0.02)情况有一定的相关性,同时podoplanin的表达与ICC患者的生存情况呈负相关,logrank检验结果为P=0.037;因此,podoplanin的表达可作为预测胆管癌患者术后生存和肿瘤侵袭转移的指标。2.对CAFs进行原代培养以及通过免疫荧光和流式细胞学的方法,对CAFs特异性标志物Vimentin、a-SMA和FSP1进行鉴定。CAFs中podoplanin的过表达能够引起其迁移能力的明显增加,而对其增殖能力和HDLECs成管能力没有显著的影响;Western Blot结果显示,podoplanin在CAFs中的过表达能引起ERM、Cofilin和MLC-2等蛋白磷酸化水平的上升。比起QBC939细胞,Ad-podoplanin CAFs与Ad-vector CAFs条件培养基处理的QBC939细胞表现出更强的侵袭能力,而在两个条件培养基处理组过的QBC939组侵袭能力没有明显的差异。裸鼠致瘤实验结果显示,CAFs中podoplanin的过表达能够引起肿瘤体积的明显变大。3.Podoplanin在QBC939胆管癌细胞系中的过表达能够增强QBC939细胞的侵袭能力;同时也能影响肝转移的发生,但没有显著差异;ICC患者临床样本的IHC结果显示,podoplanin在癌组织中的表达与间质相关标志N-cadherin和S100A4表达有明显的相关性(P=0.039和P=0.0029)。Podoplanin在QBC939中的表达能够增加它的间质表型,而在HCCC9810中能引起EMT样改变。同时,在QBC939和HCCC9810细胞系中podoplanin过表达后,Rho GTP酶家族中活化的Cdc42蛋白的表达明显上升。结论:Podoplanin在胆管癌患者标本中,肿瘤细胞与CAFs中的异常表达与患者TNM分期和淋巴结转移呈正相关。更深入的研究后发现,Podoplanin在胆管癌细胞系中的过表达能够诱导EMT样改变以及激活Cdc42蛋白来促进肿瘤侵袭;同时其在CAFs中的表达也能增强CAFs的迁移能力。因此,podoplanin在胆管癌进展中可能起到重要作用,并有望成为重要的预测指标和潜在的治疗靶点。