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研究背景和目的生物免疫疗法因具有对患者创伤及毒副作用小、效率高、对多发病灶或转移的恶性肿瘤同样有效、远期抗癌效果良好等优点,成为癌症治疗的研究热点。研究发现,病毒除了对肿瘤的特异性杀伤作用外,还能够激活宿主机体免疫系统对肿瘤的免疫应答,因此溶瘤病毒疗法成为一种新的生物免疫治疗方法。到目前为止,NDV作为单股负链RNA的副粘病毒,其抗肿瘤效果的基础研究发现,NDV不仅能够直接特异性杀伤肿瘤细胞,而且其通过对宿主免疫系统的刺激,抗肿瘤效果也很显著。我们课题组利用分离自江西鄱阳湖野鸭的NDV野生弱毒株(命名为WDK/JX/7793/2004,简称NDV7793)进行抗瘤的基础研究,证实NDV7793不仅能在体外激活NK细胞、CD4+T细胞,还能在体内能通过TRAIL在内的多种途径增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性。本课题旨在研究NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用,探讨NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)免疫功能的影响,为NDV7793作为生物免疫治疗剂应用于临床实践提供实验依据。研究内容和方法1.NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制常规培养小鼠肝癌H22细胞,将约1×106个小鼠肝癌H22细胞注射至小鼠右侧腋下,建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型。小鼠肝癌皮下移植瘤模型建立成功后,给予扩增及纯化后的NDV7793瘤内注射,连续给药天数分别为Id、2d、3d、4d、5d、6d和7d后,PBS同样连续给药作为对照组,通过对其生存期及瘤内TIL中CD4+CD25+CD127、low调节性T细胞(Treg)、CD8+T细胞比例的检测选择NDV7793最佳给药天数。根据最佳给药天数给药：小鼠肝癌皮下移植瘤模型建立成功的80只荷瘤小鼠随机分成PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组、流感病毒(FLU)对照组、NDV7793给药组,各组均为20只,瘤内注射给药,0.1mL/只,从建模成功后开始连续给药4天。每组随机选取10只小鼠,对各组小鼠进行生存分析。剩余小鼠于停药24h后处死,剥取肿瘤组织称重,计算抑瘤率。2.NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤内TIL免疫功能的影响无菌剥取的肿瘤组织研磨后用Percoll梯度离心法获取TIL,得到的TIL细胞计数后分作三个部分：(1)取2×106个TIL细胞用抗体孵育后,上流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T细胞占总TIL细胞的比率；(2)TIL细胞放在加有完全培养基的细胞培养管中,培养16h后,收集上清液,用ELISA试剂盒测定IL-2、IFN-γ、TNF-α的浓度；(3)TIL作为效应细胞与CFSE标记后的小鼠肝癌H22、Hepa1-6靶细胞按5：1效靶比充分混合,培养4h后,加入PI,流式细胞术检测CFSE+PI+细胞即死亡的靶细胞的百分率。研究结果1.NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤的抑制1)小鼠肝癌皮下移植瘤建模成功率为97.5%(78/80)。2)分析NDV7793给药时间不同小鼠生存期可得：NDV组的荷瘤小鼠的生存期随着NDV7793给药天数增加而发生改变,而PBS阴性对照组的荷瘤小鼠的生存期不会因此而发生改变；NDV7793给药4d的荷瘤小鼠生存期最长。3)分析各组给药后生存期可得：NDV给药组生存期显著长于IL-2阳性对照组以及PBS阴性对照组和FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义。4)分析各组给药后的抑瘤效果可得：NDV7793给药组的荷瘤小鼠的肿瘤重量比PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组、FLU给药对照组低,P<0.05,差异有统计学意义；NDV7793给药组对H22肝癌移植瘤的抑制率明显高于PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组、FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义。2.NDV7793对小鼠肝癌皮下移植瘤内TIL免疫功能的影响1)分析NDV7793给药时间不同的分离自荷瘤小鼠肿瘤TIL的CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T细胞占总TIL比例可得：NDV给药组CD4+CD25+CD127lowTreg占总TIL百分率较PBS阴性对照组低,P<0.05,差异有统计学意义；NDV7793给药1d-4d,随着NDV给药天数的增加,CD4+CD25+CD127lowTreg占总TIL百分率反而下降,CD8+T占总TIL百分率随着升高,但是NDV7793给药4d-7d,随着NDV给药天数的增加,CD4+CD25+CD127lowTreg占总TIL百分率随着增加,CD8+T占总TIL百分率则随之下降,NDV7793给药4d的小鼠瘤内CD4+CD25+CD127lowTreg占总TIL百分率最低(2.07±0.36)%、CD8+T占总TIL百分率最高(20.04±1.44)%。2)分析各给药组分离自荷瘤小鼠肿瘤的TIL数量及CD4+CD25+CD127lowTreg、CD8+T细胞占总TIL比例可得：NDV给药组分离自荷瘤小鼠肿瘤的TIL数量高于PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组以及FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义；NDV给药组TIL的CD4+CD25+CD127lowTreg与总TIL的比例低于PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组以及FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义；NDV给药组TIL的CD8+T与总TIL的比例高于PBS阴性对照组、FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义,但NDV7793给药组TIL的CD8+T与总TIL的比例与IL-2阳性对照组相比,P>0.05,差异无统计学意义。3)分析各给药组分离白荷瘤小鼠肿瘤的TIL细胞培养上清IL-2、IFN-γ、TNT-α浓度结果可得：NDV给药组TIL细胞培养上清IL-2、IFN-γ、TNF-α的平均浓度高于PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组,以及FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义。4)分析各给药组分离自小鼠肝癌皮下移植瘤的TIL对小鼠H22、Hepa1-6肝癌细胞株的杀伤率可得：NDV给药组TIL对小鼠H22、Hepa1-6肝癌细胞株的杀伤率高于PBS阴性对照组、IL-2阳性对照组以及FLU给药对照组,P<0.05,差异有统计学意义。结论1. NDV7793可以抑制小鼠肝癌移植瘤的生长,NDV7793可以使荷瘤小鼠的生存期延长,且NDV7793给药时间不同,延长生存期各异。2.NDV7793给药可以促进分离自小鼠肝癌皮下移植瘤的TIL增殖,可以改变分离白小鼠肝癌皮下移植瘤内TIL的CD4+ CD25+ CD127l0WTreg、CD8+T细胞占总TIL比例；NDV7793给药后,CD4+ CD25+ CD127l0WTreg、CD8+T细胞占总TIL比例随着给药时间的不同而有所变化,同时NDV7793给药还可上调分离自小鼠肝癌移植瘤瘤的TIL细胞的体外培养上清IL-2、IFN-γ、TNF-α的浓度水平；同时NDV7793给药尚能显著提高分离自小鼠肝癌移植瘤瘤内TIL体外对小鼠H22、Hepa1-6肝癌细胞株的杀伤作用。