黑星病是目前我国梨产区的主要病害之一,危害梨叶片及果实。生产中发现,‘黄冠’梨表现出对黑星病的高度抗性,而‘雪花’属易感病品种。但目前对梨抗黑星病的机制尚不明确。Ca²⁺、NO和ROS常常作为细胞信使或是信号分子参与植物对逆境胁迫的抗性反应。因此,本研究以‘黄冠’和‘雪花’梨为试材,首先通过高通量测序分析黑星菌侵染前后梨差异表达基因,再从细胞和分子水平比较分析2个不同抗性梨品种受黑星菌侵染后胞内Ca²⁺、NO和ROS的差异及其与水杨酸信号通路的内在联系,最后研究梨防御酶系对黑星菌的响应情况及外源Ca²⁺和NO的缓解效应。明确这些问题将为阐明梨抗黑星病的信号转导机制提供理论依据。所获得的研究结果主要有以下几个方面:1.对Venturia nashicola侵染72h的‘黄冠’梨叶片进行高通量测序,共得到3609个DEGs,其中有1692个上调表达,有1917个下调表达,其中主要涉及植物病原菌互作、内源激素信号转导、物质合成与代谢,以及植物抗性等方面;分析了植物与病原菌互作的信号网络,发现梨可能通过Ca²⁺、NO和ROS信号与SA信号途径联系,激活病程相关蛋白,提高抗病性。2.对‘雪花’梨和‘黄冠’梨原生质体Ca²⁺的时空变化特性进行了研究。利用Fluo-3 AM酯化型探针对梨胞内Ca²⁺荧光强度及变化进行了动态分析,发现黑星菌能够在短时间内引起梨胞内Ca²⁺水平的上升,但在品种之间存在差异;Ca²⁺亚细胞定位的研究也观察到胞内钙沉淀随侵染时间的延长而增多的现象;钙抑制剂（EGTA、LaCl₃和BAPTA）和黑星菌共处理的研究结果显示,细胞钙离子通道抑制剂LaCl₃和钙螯合剂能显著抑制胞内Ca²⁺水平,而胞内钙释放抑制剂无明显抑制效果,因此梨胞内Ca²⁺水平的升高可能主要是由于细胞间隙Ca²⁺内流作用产生的。2个梨品种钙感受器相关基因的qRT-PCR分析结果表明,黑星菌诱导了抗病品种‘黄冠’梨相关基因的上调表达,而在‘雪花’中的诱导效果不显著,这可能是2种梨细胞内钙信号差异所导致的。3.DAF-FM DA和DCFH-DA荧光探针分析结果表明,黑星病菌侵染诱导了‘雪花’和‘黄冠’梨原生质体NO和ROS荧光强度的增加,其中,‘黄冠’梨细胞NO的变化较早,但在处理后期出现下降,而‘雪花’细胞NO水平呈逐渐上升的规律;在对ROS荧光强度的检测中也得到类似的结果。随后我们对梨细胞NO的来源进行了探讨,认为感病品种‘雪花’梨NO主要由硝酸还原酶NR催化形成,而‘黄冠’梨NO可能受到一氧化氮合酶NOS和NR共同的催化作用;此外,研究发现,钙抑制剂能够显著抑制梨细胞NO和ROS水平,NO抑制剂（L-NAME和NaN₃）对ROS的积累有抑制作用,但对Ca²⁺无显著影响,ROS清除剂也不会抑制胞内NO和Ca²⁺,但CAT对细胞NO含量有一定抑制效果,因此,本研究认为Ca²⁺处于NO和ROS的上游,NO处于ROS的上游,而H₂O₂对NO产生有调控作用。4.分析了黑星菌对2个梨品种SA合成及其介导的调控因子表达的影响,并探讨了Ca²⁺和NO与SA的相互关系。结果表明,黑星菌对‘黄冠’梨SA的诱导效果显著高于‘雪花’梨;通过调控NPR1和MAPK,提高了病程相关基因（PR1和PR5）的表达水平;此外,Ca²⁺和NO对梨SA信号通路具有激活作用。5.黑星菌侵染2个梨品种叶片后,对与抗病性相关的生理生化变化及相应基因的表达情况进行了研究,并开展了关于外源CaCl₂与SNP处理对黑星菌侵染伤害的缓解效应研究。结果发现,黑星菌对2个品种叶片叶绿体造成了不同程度的破坏并降低了叶绿素的含量,增加了MDA的积累,且对感病品种‘雪花’梨的伤害更为严重;黑星菌促进了梨多种保护酶（SOD、POD、CAT、APX和几丁质酶）活性及相应基因的表达水平,且对抗病品种‘黄冠’的诱导程度更高;外源Ca²⁺和NO通过提高梨叶绿素、保护酶活性和表达水平,增强了对黑星菌的抵抗能力。Venturia nashicola侵染梨细胞并打开质膜钙通道,通过离子内流的作用提高了胞质内Ca²⁺水平,游离Ca²⁺与各类钙感受器（蛋白）结合产生胞内特异性钙信号,并诱导了NO和ROS信号分子的生成;而3种细胞早期信号共同作用激活植物中与SA相关的抗病信号转导通路,促进SA合成的同时诱导关键调控因子NPR1和MAPK的表达,从而提高了病程相关基因（PR1和PR5）的表达水平,PRs蛋白积累;另外,梨细胞Ca²⁺和NO可能通过增加叶绿素含量,降低MDA积累,并提高抗病相关的保护酶活性的途径,保护植物光合作用的同时,维持细胞内正常的氧化还原状态,从而使梨对黑星病菌的侵染表现出抗性。