研究背景随着生活水平的提高和医疗条件的改善,人民群众的平均寿命得以延长,但同时肿瘤的发病率也在逐年增加。目前,肿瘤的治疗方法主要采取手术和放化疗。但很多部位的肿瘤手术很难彻底清除干净,放化疗对患者本身也是一种伤害,而且肿瘤易复发、易转移,所以肿瘤的治疗仍是一个难题。肿瘤的研究,目前主要是通过三个方面进行：抑制其增殖促进其凋亡；抑制肿瘤细胞的分裂周期；抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。本实验的实验设计也按此思路进行。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物,广泛存在于蔬菜、水果等天然植物中,目前已证明槲皮素有多种药理作用,如抗炎作用、抗纤维化作用、抗氧化作用、抗病毒作用等。文献报道槲皮素也有抗肿瘤的作用,但是其对胶质瘤细胞U87的影响及其作用机理仍未完全阐述清楚,因此,本研究中第一部分是探究槲皮素对胶质瘤U87细胞的影响,也是我们研究肿瘤的一个开端。GMFG (Glia Maturation Factor-γ)胶质成熟因子γ是一种17KD的蛋白,主要在胸腺、脾脏、肺、肠中表达,在淋巴细胞、内皮细胞等表达量较高。GMFG是一种与GMFB高度相似的基因,目前的研究多是针对GMFB展开的,关于GMFG的研究仍然较少。根据文献报道,GMFG与免疫细胞的趋向性运动相关,所以我们本文重点研究GMFG与肿瘤细胞的侵袭迁移是否有关；GMFG与丝切蛋白结构高度相似,且有文献报道GMFG与细胞骨架的重建有关,所以本文的另一个侧重点是研究GMFG与细胞骨架的关系。综上所述,本研究主要分为以下三个部分：第一部分槲皮素对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响及其可能机制一、实验目的用槲皮素处理胶质瘤U87细胞检测其对细胞增殖及凋亡的影响,并且探究槲皮素抑制肿瘤细胞U87侵袭迁移的分子机制。二、实验方法1.用MTT方法检测槲皮素对肿瘤细胞U87增殖率的影响：将对数生长期的胶质瘤U87细胞铺在96孔板中,将其分为四组,分别是对照组,Q50组,Qloo组,Q150组,每组六个复孔。细胞贴壁后吸弃原来的培养基,加入含槲皮素的培养基。作用48h每孔中加入MTT溶液(5mg/ml)20ul。孵育4h,在多功能酶标仪下测定各组OD值。2.用流式细胞仪测定上述分组中各组细胞凋亡率：将处于对数生长期的U87细胞分别用槲皮素浓度为Oumol/L、50umol/L,100umol/L,150umol/L的培养基处理48h；用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集各组细胞,加入500u1的Binding Buffer悬浮细胞；依次加入5ul Annexin V-FITC、5ul Propidium Iodide混匀；室温、避光、反应5-15min；1小时内用流式细胞仪检测。3.利用RT-PCR技术检测上述各组MDM2的mRNA含量：按照Trizol说明书提取各组mRNA,检测各组mRNA含量。4.利用Western Blot检测各组中Caspase-3、P53、MMP-2、MMP-9的表达。三、实验结果1.槲皮素对胶质瘤细胞U87增殖的影响：相对于对照组,Q50、Q100、Q150均能明显抑制细胞的增殖率,且随着槲皮素浓度增高其增殖抑制率升高。2.槲皮素对胶质瘤U87细胞凋亡率的影响：流式细胞仪检测,Q50、Q100、Q150三组细胞凋亡率明显高于对照组,且与槲皮素浓度呈正相关。3.RT-PCR结果显示随着槲皮素浓度的增加,MDM2的mRNA表达量逐渐增加。4. Western Blot结果显示随着槲皮素浓度的增加,Caspase-3蛋白表达逐渐升高,但是P53表达在Q50时升高,Q100、Q150时反而降低；除此之外,随着槲皮素浓度的增加,MMP-2、MMP-9的蛋白表达也逐渐降低。四、实验结论第一部分实验中,主要研究了槲皮素对胶质瘤细胞U87的影响。槲皮素能抑制U87细胞的增殖,促进U87细胞的凋亡,主要是通过激活Caspase-3发挥作用,与此同时,随着槲皮素浓度的增加,还存在MDM2与P53的一个负反馈调节。此外,之前研究发现槲皮素能够抑制肿瘤细胞侵袭迁移这可能是通过抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9发挥作用。第二部分GMFG在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌细胞侵袭、迁移的关系一、实验目的研究GMFG在结肠癌肿瘤组织与正常癌旁组织中的表达情况,探究GMFG与肿瘤细胞侵袭迁移的关系。二、实验方法1.细胞培养：收集南方医院临床医学实验研究中心14种常见的肿瘤细胞SW480、SW620、LoVo、Ls-174T、HCT-116、U87、U251、KBV、A549、MAD-231、 HeLe、Caski、SiHa、MG-63。2.结肠癌组织与正常结肠癌旁组织标本：共68例患者的标本,所有标本都收集其相应的临床病理资料。3.免疫组织化学方法检测GMFG在68例结肠癌与其对应结肠癌旁组织中的表达及其分布情况。4细胞免疫荧光方法检测GMFG在结肠癌几种胞系中的表达及其分布。5.siRNA干扰GMFG的表达。6.用Transwell实验检测干扰结肠癌细胞LoVo细胞GMFG后细胞侵袭、迁移的影响,以及加入外源性重组GMFG对结肠癌细胞LoVo迁移的影响。7.Western Blot方法检测MMP-2以及vimentin、E-Cadherin的表达。三、实验结果l.GMFG在14种常见的肿瘤细胞中几乎均有表达,在结肠癌细胞系LoVo中表达最高,SW480表达最低。2.在68例结肠癌患者标本中,GMFG在结肠癌组织中的表达明显高于其在正常结肠癌旁组织中的表达,GMFG的阳性率高。在免疫组化结果中可见(GMFG在间质中表达量最高,随着恶性程度的增高,腺体细胞中GMFG的表达增多。3.Transwell结果示,相对于对照组,干扰GMFG组细胞的侵袭迁移数目均减少；加入外源性重组GMFG后,细胞迁移数目增多。4.Western Blot结果发现,干扰GMFG后,MMP-2表达降低,vimentin表达降低,E-Cadherin表达升高。四、实验结论第二部分实验首次证明了GMFG能够抑制结肠癌细胞LoVo的侵袭迁移,并且加入外源性的GMFG能促进LoVo细胞的迁移,说明内源性外源性的GMFG均能影响结肠癌细胞LoVo的侵袭迁移。除此之外,我们也发现GMFG在肿瘤组织中的表达高于正常结肠癌旁组织,GMFG的高表达可能与结肠癌的转移有关。进一步的分子机制研究发现,干扰GMFG后MMP-2降低,证明基质金属蛋白酶的改变也参与到结直肠癌侵袭迁移过程中。而且干扰GMFG后,出现了EMT现象的逆转,所以抑制GMFG表达使肿瘤细胞发生MET现象,从而降低其侵袭迁移,从而解决肿瘤转移问题。第三部分GMFG在细胞有丝分裂中后期表达及其与细胞骨架的关系实验目的研究GMFG在细胞有丝分裂过程中的分布特点及其与细胞骨架的关系。一、实验方法1.细胞株：LoVo、HUVEC、SiHa、HeLe、KBV2.细胞免疫荧光染色：取对数生长期LoVo、SiHa、HeLe、KBV、HUVEC细胞做GMFG的细胞免疫荧光染色,观察GMFG在四种细胞中的分布特点。3.细胞周期检测：将对数生长期HUVEC细胞分为三组,分别为对照组、0.5mg/mL组、1.Omg/mL,处理6h后,收集细胞用流式细胞仪检测细胞周期。4.取对数生长期的HUVEC细胞,分为三组,对照组(不加秋水仙素),秋水仙素浓度为0.5mg/L,秋水仙素浓度为1.0mg/L。处理6h后,用细胞免疫荧光染色方法观察细胞形态的变化。提取三组蛋白,检测GMFG蛋白表达量的变化。二、实验结果1.细胞免疫荧光结果发现,GMFG在LoVo、SiHa、HeLe、KBV、HUVEC五种细胞中均有表达,且发现在LoVo和SiHa细胞中均可见到GMFG的高表达,这些细胞绝大多数正处于细胞有丝分裂的中后期,从核染色中可以见到正在分离的姐妹染色体。2.秋水仙素处理HUVEC细胞后,流式细胞术检测细胞周期发现加入秋水仙素后,G0/G1期明显降低,G2期比例增多。3.秋水仙素作用HUVEC细胞后,激光共聚焦显微镜下可见随着秋水仙素浓度的增高,细胞的骨架开始回缩,且伪足回缩不再向周围伸展。而此时的蛋白结果发现,随着秋水仙素浓度的增高,GMFG的表达降低。三、实验结论第三部分实验,首次提出了GMFG在细胞有丝分裂中后期表达增高,加入秋水仙素抑制细胞的有丝分裂后,G0/G1期明显降低,G2期比例增多,GMFG蛋白的表达降低,GMFG很可能参与了细胞有丝分裂中后期细胞分离的过程。但此一部分由于时间限制,目前只是发现一些现象,对于其发生的具体机制有待进一步研究。