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目的二噁英(Dioxins)是有机氯化合物生产合成过程中产生的一类非目的性化学物质的总称,是环境中毒性极强的持续性多氯代芳香烃化合物。二噁英具有广泛的毒性作用和生物学效应,包括对免疫、生殖、发育等毒害作用,并可能造成子代畸形,同时还可能具有促癌的性质。其中,氯痤疮(chloracne)是人类暴露于二噁英后出现的敏感的皮肤效应。本研究以患有氯痤疮的男性工人作为研究对象,取其患处皮损组织活检标本作为生物标本,采用荧光定量PCR技术分析皮损处组织中AhR、CYP1A1、GSTA1、c-fos和TGF-α五个基因表达的诱导程度；采用免疫荧光分析方法,检测磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)和磷酸化丝裂原激活蛋白激酶(p-MAPK)蛋白表达；采用mRNA荧光原位杂交法与激光扫描共聚焦显微镜结合及免疫组织化学方法,测定角蛋白17(CK17)和角质形成细胞转谷氨酰酶(TGk)基因和蛋白两个水平在表皮层表达分布情况；同时进行体外细胞培养实验,以HaCaT细胞为体外模型,采用RT-PCR技术分析TCDD对体外培养细胞内AhR和TGF-α基因表达的影响。综合以上研究,为二噁英诱发氯痤疮发病机制的研究提供了理论依据。
方法本次实验以天津市某化工厂生产五氯酚钠车间患有氯痤疮的男性作业工人为患病组,对照人群为天津市区无职业接触史的正常人群。遵照“最小创伤”的原则,采取研究对象患病处直径为0.5cm,深度为0.2cm的皮肤,对照人群于相应部位取同样大小的皮肤,用荧光定量PCR技术检测皮损处组织中AhR、CYP1A1、GSTA1、c-fos和TGF-α五个基因表达的情况；免疫荧光方法检测p-EGFR和p-MAPK蛋白表达的情况；采用mRNA荧光原位杂交法与激光扫描共聚焦显微镜结合及免疫组织化学方法,测定CK17和TGk基因和蛋白两个水平在表皮层表达分布情况体外细胞培养实验中,对人角质形成细胞进行体外TCDD染毒,分为5个染毒组和1个对照组,染毒后6、12、24和48h进行MTT细胞活力检测,并观察细胞增殖程度；同时应用RT-PCR对24hTCDD染毒组进行AhR和TGF-α基因表达的测定,并分析二者间的关系。
结果各项指标测定结果如下：
1、资料基本特征描述：本研究调查了氯痤疮组12人,平均年龄(52.08±7.62)岁；对照组12人,平均年龄为(51.42±5.30)岁。两组人群在年龄、身体质量指数(BMI),吸烟和饮酒状况的分布不存在差别,均衡性良好。 2、对AhR、CYPIA1、GSTA1、c-Fos、TGF-α基因的诱导：二噁英的长期暴露引起氯痤疮患者皮损处皮肤组织中AhR、CYPIA1、GSTA1和c-fos基因mRNA表达水平均不同程度的诱导,表现为诱导上调,分别为对照组的2.3倍、5.2倍、4.3倍和4.5倍,差别有统计学意义(P<0.05)。而TGF-α mRNA表达含量与对照组比较差别无统计学意义(P=0.15)。
3、吸烟对患病组和对照组皮肤组织中CYPIA1 mRNA表达水平的影响：在对照组12人中,吸烟者9人,不吸烟者3人,吸烟组皮肤组织中CYPIA1 mRNA表达水平与不吸烟组相比虽有所增加,但经统计学分析差别无统计学意义(P=0.721)。患病组12个人中,11个人为吸烟者,仅有一人不吸烟。
4、p-EGFR和p-MAPK蛋白表达情况：氯痤疮组中p-EGFR和p-MAPK均呈阳性表达,p-EGFR主要分布在细胞膜和细胞浆,尤以细胞膜附近最明显；p-MAPK的阳性信号主要呈核浆型。对照组中均阴性。
5、CK17和TGk基因和蛋白两个水平在表皮层表达分布情况:CK17 mRNA和CK17蛋白在正常皮肤各层染色阴性,在氯痤疮患者皮肤组织中均有表达,阳性表达主要在棘细胞层。TGk mRNA和TGk蛋白在对照组仅见颗粒层阳性,其它各层染色阴性；在氯痤疮组人群中,TGk mRNA和TGk蛋白染色从皮损颗粒层向棘细胞层扩散延伸,染色强度明显增强。
6、细胞增殖程度的改变：无论染毒与否,人角质形成细胞随培养时间的延长均呈现生长增殖的趋势,但在不同的染毒时间组,细胞生长增殖随浓度增加的变化趋势并不相同。在染毒6、12和24小时组,细胞随TCDD浓度的增加而不断增殖,且增殖程度与染毒浓度间存在一定的相关关系,相关系数分别为0.561(P<0.01)、0.687(P<0.01)和0.720(P<0.01)。在48小时组,随染毒浓度的增加细胞增殖表现为抑制状态,在浓度为7×10-11～7×10-8M范围内细胞增殖程度分别下降为对照组的95.56％、90.82％、86.61％、81.14％,且增殖程度与浓度呈高度负相关,相关系数为-0.829。
7、细胞内AhR和TGF-α的诱导：结果显示,随着TCDD浓度的增高,细胞中AhR的相对表达量呈现下降的趋势,相关系数为-0.548;各染毒组与对照组相比,7×10-10M和7×10-9M两组与对照组之间的差别有统计学意义(P<0.01),且它们的表达相对量分别为对照组的55％和45％。TGF-α mRNA的相对表达量随浓度的增加则呈现上升的趋势,相关系数为0.695(P<0.01);在7×10-10M和7×10-9M两个高浓度组,相对表达量与对照组的差别具有统计学意义(P<0.05),且其相对表达量是对照组的2.6倍、3.8倍。同时对AhR与TGF-αmRNA相对表达水平进行相关分析,两者呈负相关,相关系数为-0.561(P<0.05)。结论氯痤疮患者皮损处AhR,CYP1A1,GSTA1,和c-fos基因的表达水平明显上调,表明AhR/ARNT途径很可能在二噁英诱导的氯痤疮发病机制中发挥着重要的作用,二噁英有可能通过AhR依赖的方式增加了皮损处组织中SRC活性,进而引起c-fos基因的表达水平的上升,这种持续的激活状态再从多方面干扰细胞正常的增殖和分化,从而导致氯痤疮的持续存在。氯痤疮患者皮肤组织中EGFR和MAPK呈异常活化状态,表明它们很可能参与了氯痤疮表皮细胞过度增殖的调节。同时氯痤疮患者表皮CK17和TGk的异常表达,表明二噁英干扰细胞正常的增殖和分化,从而导致氯痤疮的发生发展。
体外细胞培养实验结果表明,在一定的染毒时间内(6小时至24小时),TCDD对体外HaCaT细胞的增殖有促进作用,并且促进增殖的能力与染毒浓度之间呈正相关关系；当染毒时间延长到48小时后,TCDD对细胞生长增殖的影响则表现为抑制作用；同时TCDD可诱导细胞内TGF-α的表达并下调AhR表达,且两者间存在紧密的相关关系。体外细胞培养实验结果并不能直接外推到人体。