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我们前期实验发现,肿瘤细胞释放的自噬小体(Tumor-released autophagosomes, TRAP)可被B细胞所摄取,诱导B细胞活化并促进B细胞分泌抗体和细胞因子,特别是分泌高水平的IL-10。而可分泌高水平的IL-10,是Bregs的重要特征。但是肿瘤细胞释放的自噬小体是否可诱导B细胞进一步分化为IL-10+B细胞或者Bregs,目前尚不清楚。目的：研究肿瘤细胞释放的自噬小体(TRAP)能否进一步诱导B细胞分化为IL-10+B细胞；探讨TRAP诱导产生的IL-10+B细胞是否有免疫抑制功能；探讨TRAP诱导IL-10+B细胞的物质基础及机制：研究肿瘤患者体内是否含有自噬小体以及是否可诱导几-10+B细胞的产生。方法：1.采用]TRAP体外刺激野生型小鼠脾细胞,同时用LPS刺激脾细胞作为对照,72h后收获细胞及细胞培养上清,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。磁珠分选小鼠B细胞,与不用浓度的TRAP 37℃共孵育72h；或与E.G7-OVA细胞来源的TRAP, E.G7-OVA细胞裂解液或LPS共孵育72h；或分别与肿瘤培养上清,等体积去除TRAP的肿瘤培养上清,以及等体积培养上清所获TRAP共孵育72h,收集培养上清,ELISA法测检测培养上清中IL-10的分泌水平。分选小鼠B细胞,在体外与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B及IL-10-B细胞表面分子表达的差异(CD5、CD1d、CD21、CD23、CD43、CD86、MHC Ⅱ)。TRAP经尾静脉注射小鼠(同时用PBS注射组作为对照),第7天取脾脏细胞,通过计数并结合流式细胞术检测TRAP体内诱导产生IL-10+B细胞的比例及其表面CD5、CD1d的表达。2.分选出WT C57BL/6小鼠的CD4+T和CD8+T细胞并用CFSE标记,放入有抗CD3抗体预包被的孔板中并加入抗CD28抗体以刺激T细胞增殖。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的WTB细胞或IL-10-/-B细胞共培养或用Transwell小室隔开培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。分离OT-1小鼠脾细胞并用OVA257-264肽刺激其增殖,同时与E.G7-OVA(OVA+)或EL4(OVA)细胞来源的TRAP诱导的B细胞共孵育,96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT C57BL/6小鼠于第0天皮下接种E.G7-OVA肿瘤细胞,小鼠荷瘤成功后,于第4、7、10天DC/OVA疫苗皮下免疫荷瘤小鼠,并于第5、8天过继转移OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导的B细胞、并以单独B细胞作为对照,定期测量实体瘤大小及观察荷瘤小鼠的存活情况；末次免疫后第七天,取各组小鼠的脾脏细胞并用OVA蛋白再刺激24h,流式细胞术检测脾脏细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例；72小时后收获细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的水平。3.分选WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-、-小鼠B细胞,并用TRAP刺激不同时间(0h,1h),流式细胞术检测INF-κB通路中p65蛋白磷酸化情况；TRAP刺激上述B细胞72h后,收集细胞并检测IL-10+B细胞的比例。CFSE标记的WT C57BL/6小鼠CD4+T和CD8+T细胞分别与与TRAP诱导的WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B细胞共同放入有抗CD3抗体预包被的孔板培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的B细胞,共孵育72-96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT小鼠B细胞用不同浓度的NF-κB活化抑制剂预处理后,与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。4.采用HMGB1抗体封闭TRAP中的HMGB1抗原表位,随后与磁珠分选的小鼠B细胞共孵育,流式细胞术检测B细胞IL-10的表达,探讨HMGB1对TRAP诱导B细胞分化为IL-10+B细胞的影响。建立稳定表达HMGB1-shRNA的细胞株,提取TRAP并与分选的B细胞共孵育。72h后收获细胞培养上清,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。分选的B细胞与未破碎的TRAP或等量超声破碎后的TRAP共孵育72h,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。5.收集14例肿瘤患者胸腹水,通过高速离心的方法获取提取物；并通过流式细胞术、Western blots、电镜等方法鉴定提取物是否含自噬小体以及其表面HMGB1的表达量。分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),并与14例肿瘤患者胸腹水来源自噬小体共孵育,流式细胞术检测PBMC中IL-10+B细胞比例变化；并分析胸腹水来源自噬小体中HMGB1的含量与诱导产生的IL-10+B细胞是否具有相关性。纯化健康献血者外周血CD4+T、CD8+T细胞并用CFSE标记,放入有抗CD3抗体预包被的孔板中刺激T细胞增殖。同时,在抗CD3抗体诱导的T细胞增殖体系中加入自噬小体诱导的B细胞,共孵育72-96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。结果：1.与肿瘤细胞裂解液刺激组相比,TRAP体外诱导小鼠B细胞分化为IL-10+B细胞的比例显著增高。肿瘤细胞培养上清也可刺激B细胞分泌IL-10,并与等量培养上清中所获TRAP的刺激效果没有明显差别；但去除TRAP的肿瘤细胞培养上清刺激B细胞分泌IL-10明显下降。TRAP体外诱导产生的IL-10+B细胞的表型特征为：CD5+CD1d+MHC-Ⅱmid。TRAP体内亦可诱导IL-10+B细胞的表达,且相较于IL-10-B细胞,CD5+CDldhigh细胞比例显著升高(36.7%vs 11%)。2.抗鼠CD3/CD28单抗能够诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖,CFSE的衰减率分别为65%和81%,而加入TRAP诱导IL-10+B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别下降为20%和14%；进一步采用Transwell小室培养方法将TRAP诱导的B细胞和T细胞隔开,结果发现：CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为5%和12%,而且与TRAP诱导的B细胞和T细胞混合培养导致的CD4+T细胞和CD8+T细胞CFSE衰减率下降(4%和10%)相比较,没有明显差异。同时发现,来源于IL-10-/-小鼠B细胞经TRAP诱导后,没有影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为45%和71%)。在OT-1 CD8+T细胞增殖体系中,OVA257-264肽可刺激OT-1 CD8+T细胞增殖(CD8+T细胞的CFSE衰减率为60.1%)；加入OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导B细胞均可抑制CD8+T细胞的增殖(CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为9.4%和12.3%)。在C57BL/6小鼠的E.G7-OVA皮下移植瘤模型中,与未免疫组相比,DC/OVA免疫后IFN-γ+CD4+T细胞(0.8% vs 2.9%)和IFN-γ+CD8+T细胞(1.1% vs 3.2%)的比例显著升高；而过继输注OVA+TRAP诱导的B细胞则导致IFN-γ+CD4+T细胞(2.9% vs 0.9%)和IFN-y+CD8+T细胞(3.2% vs 2.0%)的比例较DC/OVA免疫组显著下降；与过继转移OVA+TRAP诱导的B细胞效果相似,过继OVA-TRAP诱导的B细胞亦导致IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例较DC/OVA免疫组显著下降(0.6% vs 2.9%; 1.6% vs 3.2%),且两种B细胞效果无明显差异(0.9% vs 0.6%; 2.0% vs 1.6%)。未免疫组荷瘤小鼠中位生存时间为20天,DC/OVA免疫组小鼠和未刺激B细胞组的中位生存时间分别为31天和29天,但过继转移OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导B细胞组的中位生存时间分别为22天和23天,明显短于未刺激B细胞组。3.与未刺激组相比(IL-10+B细胞比例：0.8%),TRAP诱导WT及TLR4-/-小鼠B细胞分化为IL-10+B细胞的比例显著升高(2.1%；2.7%),而TLR2-/-、 MyD88-/-小鼠IL-10+B细胞比例无明显变化(1.0%；0.9%)。与未处理B细胞组相比,TRAP诱导NF-κB活化抑制剂预处理的B细胞分化为IL-10+B比例显著降低,且NF-κB活化抑制剂浓度越高,TRAP诱导产生的IL-10+B细胞比例越低(1.1% vs 1.6%; 0.8% vs 1.6%; 0.7% vs 1.6%)。TRAP与WT或TLR4-/-B细胞孵育后可引起下游NF-kB信号通路中p65的磷酸化,而TLR2-/-、MyD88-/-B细胞中未见p65磷酸化。抗鼠CD3/CD28单抗能够诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别为65%和81%)；加入TRAP诱导的WT B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别降至20%和14%；加入TRAP诱导的TLR4-/-B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率为24%和23%;而加入TRAP诱导的TLR2-/-B或MyD88-/-B细胞没有影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(75%和71%：87%和81%)；4.流式细胞术检测发现92.7%的TRAP表面表达HMGB1。与未预处理TRAP相比,HMGB1封闭抗体预处理TRAP诱导B细胞分化为IL-10+B的比例显著降低(0.8% vs 2.2%)；而同型对照抗体处理TRAP对诱导IL-10+B细胞的产生无影响(2.0% vs 2.2%)。与WT B16-F10来源的TRAP及转染Control-shRNAB16-F10来源的TRAP相比,转染HMGB1-shRNA B16-F10来源的TRAP刺激B细胞分泌IL-10的水平显著降低。膜结构完整的TRAP可诱导B细胞分泌高水平的IL-10,而超声破碎后的TRAP则无此能力。5.流式细胞术检测发现82%的提取物表面表达LC3。与HepG2细胞来源的TRAP相似,Western blot检测发现提取物中LC3Ⅱ的表达量要高于LC3 Ⅰ。电镜观察提取物形态,发现提取物中含有大量具有双层膜结构的自噬小体,大小不一,平均直径在200-1000nm不等。14例肿瘤患者胸腹水来源自噬小体(MedAP)均表达HMGB1,且表达水平参差不齐。与HepG2细胞来源的TRAP相似,14例MedAP均可诱导IL-10+B细胞的产生；用Spearman等级相关分析对MedAP中HMGB1的含量与诱导产生的IL-10+B细胞的比例进行相关性分析,结果证实MedAP诱导4例健康献血者PBMC产生IL-10+B细胞的比例均与MedAP中HMGB1的含量成正相关(相关系数分别为R=0.73,P<0.01; R=0.68, P<0.01; R=0.67, P<0.05; R=0.87, P<0.0001)。抗人CD3单抗能够刺激CD4+T和CD8+T细胞增殖,CFSE衰减率分别为49.9%和61.7%;加入MedAP诱导的B细胞后CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别降至27.1%和43.8%,而加入未刺激的B细胞未影响CD4+T、CD8+T细胞的增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为53.8%和62.5%)。结论：1.肿瘤细胞可自发释放自噬小体(TRAP)到细胞外；TRAP体内、体外均可诱导B细胞分化为分泌高水平IL-10、具有CD1d+CD5+细胞表型特征的调节性B细胞。2. TRAP诱导IL-10+B细胞主要通过IL-10抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖、而不依赖细胞间相互接触,且以抗原非特异性的方式发挥抑制性功能；过继输入TRAP诱导IL-10+B细胞能以抗原非特异性方式抑制DC疫苗诱导的T细胞免疫应答及其介导的抗肿瘤作用。3. TRAP诱导IL-10+B细胞及其抑制T细胞增殖依赖TLR2-MyD88-NF-κB信号通路。TRAP膜结构的完整性及其携带的内源性分子佐剂一膜结合型HMGB1对TRAP诱导IL-10+B细胞的产生至关重要。4.肿瘤患者胸腹水中存在自噬小体(MedAP)。不同肿瘤患者来源MedAP均表达HMGB1,其表达水平参差不齐。MedAP能诱导人IL-10+B细胞的产生,且与MedAP中HMGB1的含量成正相关。MedAP诱导IL-10+B细胞可抑制人CD4+和CD8+T细胞的增殖。