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小檗碱对许多肿瘤的生长都有一定的抑制效果,包括肝细胞癌、结肠癌、肺癌、口腔癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌等。尽管小檗碱在胃肠道中状态稳定,但是体内吸收不好,导致血药浓度低,生物利用度也不好,影响了对其的有效利用。为了进一步降低小檗碱的毒性,增强机体对其吸收,提高其脂溶性和生物利用度,我们采用亲核取代、酰胺化、酯化等方法将小檗碱与胆酸进行偶联,探索了不同胆酸取代基在小檗碱不同取代位置对其生物活性的影响。研究发现,众多新生衍生物中,通过酯键将鹅脱氧胆酸连接到小檗碱的C-9位上合成出的2,3-Methenedioxy-9-O-(3’a,7’a-dihydroxy-5’β-cholan-24’-propy-lester) berberine (B4),有较高的生物利用度,是小檗碱的4.7倍,同时具有有显著的抗菌活性,对许多肿瘤细胞都具有显著的增值抑制作用,包括肝癌细胞(SMMC-7721, BEL-7402)、胃癌细胞(SGC-7901)、结肠癌(HCT-116)等,其中对肝癌SMMC-7721细胞的外抗肿瘤作用效果最显著,具有良好的开发前景。本论文主要借助细胞平台,运用多种实验手段,包括流式细胞术、激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳技术以及Western Blot蛋白印记等实验方法研究了B4诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。主要研究结果如下：四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测B4对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用以及对人正常肝HL-7702细胞的毒性大小,实验结果表明B4对SMMC-7721细胞的增殖抑制效果明显强于小檗碱,并且呈现一定的时间和浓度上的依赖性；B4对HL-7702正常肝细胞的毒副作用要远小于小檗碱,在0.4μM～2μM实验浓度下,B4对正常细胞的最大抑制率小于20%,毒性很小,因此将2μM作为后续实验的最大给药浓度。观察B4作用SMMC-7721细胞后其形态学特征变化主要是通过激光共聚焦显微镜(LSCM),结果表明2μM B4孵育SMMC-7721细胞48h后,细胞形态发生显著的变化,细胞核缩皱并且边缘化,核仁破碎裂解,产生凋亡小体。通过流式细胞仪分析B4诱导SMMC-7721细胞发生凋亡和对细胞周期阻滞的影响。不同药物浓度处理SMMC-7721细胞48h后,随着给药浓度的增加,处于G0/G1期和G2/M期细胞数不断减少,而S期细胞数不断增加,这表明B4能够诱导SMMC-7721细胞生长周期阻滞于S期。此外凋亡结果显示B4作用SMMC-7721细胞后,随着给药浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加并且呈现一定的浓度依赖性,但是小檗碱作用后,SMMC-7721细胞的凋亡率却很低,表明B4对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡诱导作用要显著于小檗碱。流式细胞检测B4诱导SMMC-7721细胞内ROS水平、Ca2+浓度和线粒体膜电位(△ψm)的变化,发现随着给药浓度的增加,细胞内Ca2+、ROS的水平也逐渐增加,细胞△Ψm却逐渐降低。为进一步研究ROS在B4诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起到的重要作用,我们在B4处理细胞之前,先用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞1h,再用SMMC-7721细胞孵育48h。结果显示在一定的给药浓度范围内,NAC阻止了B4诱导的细胞内Ca2+、ROS水平的升高以及细胞△Ψm的降低,表明ROS能够调控B4诱导的SMMC-7721细胞凋亡。Western Blot法主要分析了B4作用SMMC-7721细胞后常见的凋亡相关蛋白水平的变化,实验结果发现B4能诱导聚ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解产物增加以及caspase家族蛋白的活化,同时B4诱导细胞凋亡诱导因子(AIF)蛋白从线粒体易位到胞核,促使核内的DNA大量片段化,这表明B4可能通过激活caspase依赖性和非依赖性的细胞凋亡通路使部分人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。此外,用抗氧化剂NAC抑制活性氧(ROS)的活性后,B4引起的细胞生长抑制、诱导凋亡作用均被减弱,这提示B4诱导SMMC-7721细胞凋亡与细胞内ROS产生增加有关,为进一步将B4应用于肝癌的临床治疗提供一定的依据。该论文的主要研究目的就是通过几种常见的体外实验方法检测B4对SMMC-7721的肿瘤抑制活性,并对其具分子机制做简单研究,最终验证B4通过诱导细胞发生凋亡来实现其抗肿瘤作用,同时证明ROS在此过程中起到了重要的介导和调控的作用。