论文部分内容阅读
目的：（1）检测occludin在不同人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3中的表达情况，分析MCF-7、MDA-MB-231和SKBR-3细胞的恶性增殖与occludin之间的关系。（2）构建occludin基因真核表达载体，转染相对低表达occludin的MDA-MB-231和SKBR-3细胞，研究occludin对乳腺癌细胞增殖、凋亡、黏附和迁移的影响。方法：（1）RT-PCR、Western-blot和免疫细胞化学染色方法检测MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3三株人乳腺癌细胞中occludin mRNA和蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，FN蛋白黏附实验、Transwell实验观察并比较三株细胞的异质黏附性和迁移能力。（2）构建pcDNA3.1(+)-occludin真核表达载体。（3）应用Lipofectamine TM2000分别将重组载体pcDNA3.1(+)-occludin和空载体pcDNA3.1(+)转入MDA-MB-231和SKBR-3细胞，运用RT-PCR、Western-blot和免疫细胞化学染色法分析比较转染前后目的基因occludin在mRNA和蛋白水平的表达变化。（4）通过流式细胞术、Transwell、FN黏附等实验，观察转染occludin基因后对细胞周期、细胞凋亡、迁移和黏附的影响。结果：（1）MDA-MB-231和SKBR-3细胞occludin mRNA和蛋白表达水平明显低于MCF-7细胞（P<0.01），而细胞增殖速度、S期细胞所占比例均大于MCF-7细胞（P<0.05）；细胞的异质黏附性和迁移能力亦高于MCF-7细胞（P<0.01）。(2)成功构建pcDNA3.1(+)-occludin真核表达载体，经基因测序鉴定无碱基缺失、突变。（3）应用脂质体转染技术成功将occludin基因导入MDA-MB-231和SKBR-3细胞中，并检测到occludin基因高表达。（4）流式细胞术、Transwell、黏附实验结果表明，转染pcDNA3.1(+)-occludin的MDA-MB-231/pcDNA3.1(+)-occludin细胞和SKBR-3/pcDNA3.1(+)-occludin细胞与未转染的MDA-MB-231、SKBR-3细胞和转染空载体的MDA-MB-231/pcDNA3.1(+)、SKBR-3/pcDNA3.1(+)相比，生长速度减慢（P<0.01）；G0/G1细胞期比例增加，S期比例减少（P<0.01）；细胞凋亡率增加（P<0.01）；穿膜细胞数减少（P<0.01）；FN黏附细胞数减少（P<0.01）。结论：（1）紧密连接蛋白occludin与人乳腺癌细胞恶性增殖呈一定负相关性（。2）occludin基因在人乳腺癌MDA-MB-231和SKBR-3细胞中过表达可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞迁移和异质黏附性。