去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)是通过去除斑蝥素分子中2,3-甲基所得的化合物,是我国首先人工合成并拥有独立知识产权的新型治癌药物。与斑蝥素相比,它具有更低的毒性,且具有独特的升白细胞作用。已有的研究表明,去甲斑蝥素可以保护正常肝细胞免受因脂多糖(LPS)导致的损伤;减弱肾小管间质纤维化,保护肾脏;还对人身体免疫系统具有良好的调节作用。除了以上的特点之外,去甲斑蝥素还具有较强的抗癌活性,它对多种肿瘤具有良好的治疗效果。这些肿瘤包括卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肝癌等。利用抗癌药提升肿瘤细胞内的活性氧水平从而诱导细胞凋亡被认为是一条潜在的抗癌途径。活性氧的升高可以诱导细胞凋亡与自噬,使细胞死亡。关于NCTD对人绒癌及皮肤癌方面的研究仍然知之甚少。我们在前期实验研究中发现,NCTD可诱导人绒癌JEG-3细胞与人皮肤鳞状细胞癌A431细胞活性氧明显升高,至于它能否诱导这两种癌细胞凋亡及自噬等情况,值得进一步研究。第一部分:NCTD对人绒癌JEG-3细胞的增殖、凋亡和自噬的影响,以及与5-FU化疗增敏作用目的:探讨NCTD对人绒癌JEG-3细胞的增殖能力、凋亡和自噬的影响及分子机制。此外,NCTD对绒癌主要化疗药5-FU是否具有增敏作用。方法:mtt实验检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测细胞增殖周期,annexinv-fitc荧光双染法检测细胞凋亡,dapi染色法和hochest33258染色法检测凋亡细胞形态,电镜观察细胞凋亡与自噬。我们还使用相关试剂盒检测凋亡、活性氧水平、膜电位、自噬阳性细胞、mda及caspase-3,-9酶活性变化,最后用定量pcr方法检测抗氧化基因的mrna表达,western-blot法检测p21、cyclinb1、fas、fasl、bcl-2、bax、mtor、p62、beclin1、lc3-Ⅱ蛋白的表达。结果:1.nctd对人绒癌jeg-3细胞生长增殖有明显的抑制作用;nctd能引起jeg-3细胞g2期阻滞,其分子机制可能是通过增加p21蛋白表达和下调cyclinb1蛋白而引起的。2.nctd能提升jeg-3细胞中ros水平,同时细胞内总的sod酶活性降低,mda含量升高。定量pcr结果提示,抗氧化酶sod1、prdx1、prdx2、prdx3以及细胞因子il-6mrna表达随着nctd浓度的增加而降低,提示了nctd作用jeg-3细胞,诱导ros水平有可能是通过下调抗氧化物相关基因表达进行的。3通过hochest33258和dapi染色、电镜观察细胞形态及流式细胞术检测凋亡率及膜电位,结果提示了nctd明显诱导jeg-3细胞凋亡,同时细胞中bcl-2蛋白表达降低,而bax、fas、fasl蛋白表达增加4.为了探索活性氧水平升高是nctd诱导jeg-3细胞凋亡的主要原因,我们采用活性氧清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)与nctd共同作用进行反向求证。结果发现nac可逆转nctd诱导jeg-3细胞凋亡,其机制与nac能降低caspase-3、9酶活性有关。5.与单独使用nctd或5-fu比较,nctd与5fu联合使用,对jeg-3细胞具有更明显的抑制效果,其机制与增加caspase-3、9酶活性相关。6.nctd对jeg-3细胞自噬影响的实验中,我们发现,nctd能诱导jeg-3细胞自噬,其机制与mtor、akt、p62、lc3-Ⅱ及beclin1蛋白表达变化相关。为了进一步论证自噬与活性氧的关系,我们用nac与nctd共同处理细胞,发现nac可以明显减轻nctd诱导的自噬,同时使自噬相关蛋白beclin1、p62表达改变,结果提示了ros升高是nctd诱导jeg-3细胞自噬的主要原因。结论:nctd主要通过提高jeg-3细胞活性氧水平,诱导细胞凋亡、自噬,其机制可能与nctd能改变jeg-3细胞内的p21、cyclinb1、fas、fasl、bcl-2、bax、mtor、p62、beclin1、lc3-Ⅱ蛋白表达有关。另外,nctd可以抑制jeg-3细胞增殖,使细胞周期阻滞在g2期,可以对5-fu治疗绒癌具有增敏作用。本实验为nctd治疗人绒癌提供了重要的实验依据,进一步拓展了nctd作为抗癌药的应用领域。第二部分:nctd对人皮肤鳞状细胞癌a431细胞的增殖、凋亡及转移的影响,目的:探讨nctd对人皮肤鳞状细胞癌a431细胞的增殖能力、凋亡和侵袭转移的影响及分子机制。方法:mtt实验检测细胞增殖的变化,流式细胞术观察细胞周期变化,annexinv-fitc荧光双染法检测细胞凋亡,以及使用dapi染色法检测凋亡细胞形态。我们还使用相关试剂盒检测细胞活性氧水平、膜电位、sod、mda及caspase-3,-9酶活性变化。另外,我们使用小室实验检测细胞侵袭转移能力,用划痕修复法检测细胞的迁移能力,western-blot法检测p21、cyclinb1、fas、fasl、bcl-2、bax、vegf、mmp-2、mmp-9等蛋白表达。结果:1.nctd对a431细胞生长增殖有明显的抑制作用,引起a431细胞g2期阻滞。其分子机制可能是通过增加p21蛋白表达和下调cyclinb1蛋白而引起的。2.nctd能升高ros水平,诱导a431细胞凋亡率增加,同时细胞中bcl-2蛋白表达降低,而bax、fas、fasl蛋白表达增加。3.为了探索是否由于活性氧水平升高诱导a431细胞凋亡,我们采用活性氧清除剂n-乙酰半胱氨酸(nac)与nctd共同作用。发现nac可减少nctd诱导的凋亡,其机制与nac能降低caspase-3,9酶活性有关。提示nctd通过增加ros水平,诱导a431细胞凋亡。5.transwel小室、划痕修复、黏附及western-blot等实验发现,nctd对a431细胞的侵袭迁移和黏附能力均有明显的抑制,其机制可能是与nctd降低细胞内的vegf及mmp-2,-9蛋白表达水平有关。结论:nctd可明显抑制a431细胞的增殖和转移能力,并且可以通过活性氧途径诱导细胞凋亡。这些研究结果为nctd治疗皮肤癌提供了重要的实验依据,进一步扩大了nctd作为抗癌药的应用领域。