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氨基葡萄糖（GlcN）及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）作为重要的功能单糖,被广泛应用于医药、食品营养、健康保健及化妆品等领域。据报道,2019年全球氨基葡萄糖市场总额约为50亿美元。随着生活质量的进一步提高以及人口老龄化问题的加剧,GlcN和GlcNAc类医药、食品营养保健品的全球需求会持续增加。目前,GlcN和GlcNAc的工业生产方法包括化学水解法、酶转化法和微生物发酵法。相比于化学水解法和酶转化法,微生物发酵法具有原料可再生、清洁、绿色等典型特征,是解决资源、能源和环境问题的重要途径。为此,本课题以一株产GlcNAc的食品安全级枯草芽孢杆菌BSGN6 PxylA-glmS（研究室保藏）为出发菌株,采用代谢工程手段从底物转运、碳代谢、能量代谢和产物运输方面进一步提高工程菌株的生产性能。主要研究内容如下:（1）优化葡萄糖转运途径。通过敲除出发菌BSGN6 PxylA-glmS的PTSGlc系统中EIIAGlc和EIIBCGlc组分编码基因yyzE、ypqE和ptsG,实现阻断PTSGlc转运系统;使用强组成型启动子P43替换葡萄糖/氢离子协同转运蛋白载体和葡萄糖激酶编码基因glcP、glcK的原始启动子,强化B.subtilis自身的NPTSGlc转运系统;筛选不同来源的葡萄糖/氢离子协同转运载体,确定B.subtilis来源的葡萄糖/氢离子协同转运载体效果最佳,GlcNAc产量提高至10.1 g·L-1;进一步,使用起始密码子工程策略抑制竞争途径的活性,包括戊糖磷酸途径、糖酵解途径和肽聚糖合途径;最终,摇瓶中GlcNAc产量提高到13.2g·L-1,3-L发酵罐补料分批发酵达到42.1 g·L-1;（2）根据物质能量守恒原则建立数据模型,预测GlcNAc得率与合成途径强度和合成途径理论得率相关。为了提高合成途径强度,首先阻断丙酮酸的合成,迫使代谢流流向GlcNAc合成途径,GlcNAc得率提高至0.263 g·g-1 Glucose;然后,敲除磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码基因pckA,并使用组成型强启动子P43替换糖酵解途径关键基因pfkA和fbaA的原始启动子,避免磷酸烯醇式丙酮酸对其转录水平的反馈调控,GlcNAc的产量达到10.1 g·L-1;之后,强化B.subtilis自身的酮酸羧化酶的表达,敲除苹果脱氢酶编码基因melA、malS、ywkA和ytsJ,避免丙酮酸的回补;进一步,引入来源B.cereus的丙酮酸羧化酶,完全消除中心代谢副产物的合成,GlcNAc达到13.3 g·L-1,得率提高至0.325g·g-1 Glucose;（3）比较不同来源的氨基葡萄糖-6-磷乙酰化酶的功能活性,确定Anthracocystis flocculosa来源的氨基葡萄糖-6-磷乙酰化酶的效果最佳,GlcNAc产量达到14.3 g·L-1;使用强组成型启动子P43调控基因glmS的表达,避免葡萄糖对木糖诱导启动子PxylA系统的抑制,解除氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的反馈调控,GlcNAc产量达到15.9g·L-1;进一步,使用强组成型启动子P43表达调控因子GltC,同时基因组整合E.coli来源的谷氨酸脱氢酶编码基因EcglnA,GlcNAc产量提高至17.1 g·L-1;此外,确定表达 Salmonella enterica和Mycobacterium smegmatis来源的pduA和RmmH能在B.subtilis中形成胞质微室空间结构;然而,将GlcNAc合成途径关键酶afGNA1和GlmS与BMCs-H蛋白RmmH通过亲和短肽CC-Di-A/B作用固定于胞质微室空间中并未获得理想结果;（4）BP17-afGNA1胞内NADH的浓度为3.22μmol·g-1 DCW,是BP17的3.5倍,表明GlcNAc合成会导致胞内积累NADH;敲除丁二醇脱氢酶编码基因bdhA,阻断2,3-丁二醇合成途径后,GlcNAc的产量和得率都显著降低,且会导致积累溢流副产物再次合成,表明2,3-丁二醇的合成是平衡GlcNAc合成时产生NADH的结果;使用不同强度启动子表达NADH氧化酶以平衡胞内还原力水平,但都导致GlcNAc产量降低,表明非代谢偶联条件下表达NADH氧化酶,会导致胞内能量紊乱,降低工程菌株的生产性能;但将重组工程菌中产生NADH的代谢步骤用不产NADH的反应替代后能平衡重组工程菌胞内NADH水平,代谢反应包括丙酮酸到乙酰辅酶A、3-磷酸甘油醛到3-磷酸甘油酸、苹果酸到草酰乙酸和铁氧还蛋白再生。获得重组工程菌在摇瓶发酵中GlcNAc产量达到24.5 g·L-1,得率为0.468 g·g-1 Glucose;（5）最后,基于使用Illumina HiSeq平台的RNA-seq技术对工程菌BP22和BP22-afGNA1、BSGN6-PxylA-glmS和BSGN6-PxylA-glmS-GNA1进行基因组转录水平分析;从碳水化合物代谢、膜运输蛋白等方面进行深层次挖掘,将碳水化合物代谢、膜运输蛋白中上调倍数较大的基因进行表达。结果表明表达碳水化合物代谢通路基因acoC（编码二氢脂酰胺乙酰转移酶）能促进GlcNAc的合成。重组工程菌BP22-afGNA1-acoC在摇瓶发酵中GlcNAc产量达到26.8 g·L-1,在3-L发酵罐补料分批发酵中最大产量为72.1g·L-1,得率为0.41 g·g-1 Glucose,生产强度为0.68 g·（L·h）-1。