猪伪狂犬病(Pseudorabies, PR)又名奥叶基氏病(Aujeszky’s, AD)、奇痒症等,是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎等为主要特征的一种急性、高度接触性传染病,其中以猪的感染最为普遍,其主要引起母猪的繁殖障碍,主要表现为流产、死胎、木乃伊胎等;新生仔猪发生感染时,死亡率可高达100%;此外,育肥猪感染往往致使其生长缓慢,种公猪感染则导致精液品质下降甚至丧失种用价值,因此该病的发生给养猪业带来巨大的经济损失。目前,该病已被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,我国也将其列为二类动物疫病。近年来,该病的发生呈不断上升的趋势,成为当前严重危害养猪业的重要疫病之一。由于当前绝大多数的猪场主要通过使用gE基因缺失疫苗对该病进行免疫预防,因此配套使用PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒能快速、准确地对血清中PRV野毒抗体进行检测,从而能有效监测猪群中PRV野毒感染情况。为了解近年来吉林省各地区猪场中PRV野毒的感染情况,本研究采用PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒对2008～2010年间采自吉林省12个市县的152个不同规模的免疫猪场不同批次送检的3849份血清样品进行PRV野毒血清抗体检测,从而为针对感染状况日益严重的猪伪狂犬病科学防控措施的制定提供重要的理论依据。血清学调查结果显示,吉林省各地区的抗体阳性率从9.47%～40.00%不等,抗体平均阳性率为22.66%;在被检测的152个猪场中,PRV抗体阳性的猪场103个,各地区猪场阳性率从37.50%～87.50%不等,这表明吉林省各地区猪场中PRV野毒感染情况仍较为严重。此外,本研究还对不同日龄、不同性别以及不同品种猪PRV野毒感染情况进行了调查与分析,以上血清学调查结果将为吉林省针对PR防治工作的开展提供重要的理论依据。2008年11月,吉林省四平地区某猪场怀孕母猪出现流产、死胎,50多头新生仔猪临床上出现呕吐、腹泻,并伴有肌肉震颤、后肢麻痹、四肢呈游泳状滑动等神经症状,经多种抗生素治疗无效,发病后2～3 d后陆续死亡,死亡率高达100%。剖检送检病死仔猪,主要病理变化表现为脑膜充血、淤血,肺脏充血、水肿,肝脏淤血、表面散在有灰白色的坏死灶,而其他组织脏器无明显的病理变化。根据该病的临床症状及眼观病理变化,我们初步诊断为猪伪狂犬病,由于该病在临床上容易与猪繁殖障碍与呼吸综合征、猪细小病毒病、猪布氏杆菌病等相混淆,因此本研究从病理学和病原学角度对该病的发生原因进行了综合分析。首先,本实验从送检病死仔猪的心、肝、脾、肺、肾以及脑组织等进行病理学切片,从病理组织学角度对仔猪的死亡原因进行分析。病理组织学观察可见,脑组织出现“血管套”、噬神经现象等典型的非化脓性脑炎变化,据此我们推断该病变是由病毒感染所引起,同时,细菌学检测结果也排除了细菌感染的可能。此外,肝脏的部分组织坏死形成局灶性的坏死灶,该病变是PRV感染的一个重要的示病病变。为了进一步对该病进行确诊,本试验利用BHK-21细胞进行了系统的病原分离鉴定,并成功获得了1株PRV野毒,并将其命名为PRV JL/08/SP分离株。为了进一步了解PRV JL/08/SP分离株在BHK-21细胞中的增殖能力以及侵染细胞的动态过程,本研究通过制作感染细胞的超薄切片对PRV JL/08/SP病毒粒子的形态学发生过程和感染细胞超微结构的变化进行观察,观察可见,PRV在吸附到细胞膜的表面后通过膜融合的方式进入到细胞中,在胞核中进行病毒的复制,装配好的病毒以出芽方式离开细胞核进入胞浆;在胞浆内的病毒粒子又利用高尔基体的膜结构合成第二层囊膜,形成完整的病毒粒子;最后包裹有完整病毒粒子的高尔基囊泡与细胞膜发生融合,将病毒粒子释放到细胞外。该增殖过程及释放形式与之前文献报道的基本一致,这表明不同的PRV分离株在细胞中的形态发生学过程非常相似,仅在PRV囊膜获得方式上存在有一定的差异。此外,本研究还利用BHK-21细胞对其毒力进行了测定,结果显示,PRV JL/08/SP分离株在BHK-21细胞的感染滴度为10-7.2/0.1 mL,这表明该分离株具有较强的毒力;为了进一步确定该毒株的致病性,还选用对PRV最为易感的家兔以及本源动物仔猪进行了动物回归试验,均复制出与自然感染相类似的临床症状。以上我们对PRV JL/08/SP分离株进行了系统全面的鉴定,并从病原学角度对其致病性进行了初步的研究分析,据此从而确诊该病的发生是PRV野毒感染所致。由于目前各猪场中PRV野毒感染的情况仍非常普遍,在猪群中多呈隐性感染,因此也是彻底根除该病所面临的一个难题。鉴于此,当前非常有必要建立一种快速、特异、敏感的诊断方法用于PRV野毒株的检测。在控制PR的发生流行过程中,PRV基因缺失疫苗起到了非常重要的作用,其中以PRV gE基因缺失疫苗的使用最为广泛。因此,在此基础上建立一种能有效区分野毒感染和疫苗接种毒株的诊断方法对于野毒感染阳性猪的清除以及猪场的净化起到至关重要的作用。由于目前所使用的PRV gE基因缺失疫苗株均部分甚至全部缺失gE基因,而且gE基因能在野毒株中稳定表达且其本身的遗传变异性较小,因此可将gE基因作为鉴别PRV野毒株和疫苗株的一个标志基因用于PRV分子水平上的诊断。本研究在前期分离获得PRV JL/08/SP株的基础上,根据Genbank中公布的gE基因序列保守区设计特异性引物,利用PCR方法扩增并克隆了PRV JL/08/SP分离株的gE基因并进行了序列测定分析,此外,还对该基因的核苷酸及编码氨基酸同源性进行了分析。分析结果表明,与其他分离株相比,gE基因虽然存在有个别核苷酸的突变位点,但从同源性以及遗传进化分析结果来看,PRV JL/08/SP分离株gE基因仍然高度保守。因此,PRV JL/08/SP分离株的gE基因可作为鉴别PRV野毒株和疫苗株的诊断抗原,我们利用该分离株的gE基因建立用于临床样本快速检测的PCR方法,且该方法具有特异性强、敏感性高以及重复性好等优点。应用该方法对吉林省长春、四平、公主岭、吉林等地猪场送检的68份疑似PRV感染猪的脾脏、肺脏、肝脏以及脑组织等组织样本进行检测,其中样本检出阳性率为27.94%,这与之前的血清流行病学调查结果相符合,这说明猪伪狂犬病在吉林省的发生仍较为普遍。在本研究中,我们利用PRV JL/08/SP分离株gE基因建立的PCR诊断方法不仅能快速、特异地对临床样品进行检测,而且能有效地区分PRV野毒株和疫苗株,从而在很大程度上提高了PRV的检出率和准确程度,此外,该方法对于PRV的早期感染、潜伏感染以及持续感染的诊断均具有十分重要的意义,因此可为猪场中PR的净化及根除提供有力的技术支撑。此外,针对当前该病发生的严峻现状,各猪场非常有必要对该病进行净化、根除。因此,本研究在参照国外净化、根除PR成功经验的基础上,在2009～2010年应用PRV gE基因缺失疫苗并结合PRV gE-ELISA抗体检测试剂盒对吉林省6个不同规模的猪场采取免疫、监测以及淘汰等综合防治技术进行净化、根除,并在上述的6个试验猪场达到了预期的净化效果,这将为吉林省乃至全国范围内PR的净化以及根除工作的开展提供参考依据。