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提高糖酵解速度是所有以糖质原料为底物的工业发酵共同关心的问题,其中ATP/ADP、NADH/NAD+这两组辅因子是影响糖酵解速率的主要因素,若要进一步提高糖酵解代谢速率,需要保证细胞内较低水平的ATP和较高浓度的NAD+。 本文以米根霉(Rhizopus oryzae)As3.3461为研究菌株,通过:(1)抑制米根霉氧化磷酸化途径;(2)改变发酵条件调控NADH代谢途径;(3)改变呼吸缺陷型菌株的NADH代谢途径这三种策略进行调控,研究NADH/NAD+比率、能荷水平改变对米根霉丙酮酸分支点代谢流的影响,并从生理学角度探讨改变米根霉NADH/NAD+比率、能荷水平对酵解速度的影响机理。主要研究结果如下: (1)利用氧化磷酸化抑制剂鱼藤酮和菌种诱变从外源、內源两个方面降低胞内ATP水平发现,低浓度的ATP有利于解除高能荷水平对糖酵解关键酶活性的抑制作用,使磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)活性均得到提高,糖酵解速度和丙酮酸转化率得到提升。同时丙酮酸分支点中两个关键酶的活性也发生了改变,乙醇脱氢酶(ADH)的活性下降,乳酸脱氢酶(LDH)活性升高,最终导致L-乳酸的产量提高,乙醇产量下降。 (2)通过改变碳源组成、改变溶氧量、添加烟酸三种策略调节胞内NADH/NAD+比例发现,随着NADH/NAD+比率下降,ATP含量呈现一定比例的下降,有利于糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)及丙酮酸分支酶乳酸脱氢酶(LDH)活性的提高和乙醇脱氢酶(ADH)活性的下降,最终导致主要代谢产物L-乳酸产量提高,乙醇产量下降 (3)综合分析发现,米根霉细胞内较低水平的ATP和较高浓度的NAD+,有利于提高米根霉代谢速率。通过利用呼吸缺陷型菌株为实验菌株,改变碳源组成、添加 NAD+前体物烟酸,使米根霉在保持较低 ATP水平的条件下降低胞内NADH/NAD+比例,使目标产物L-乳酸积累量大幅度上升。