研究背景:骨是一种具有多种功能的复杂器官,其作用包括造血、调节和贮存关键矿物质、维持机体的平衡。当骨受到伤害时,急性炎症刺激即刻发生,导致机体的先天性免疫调节随之展开,与组织器官共同作用下,调控局部的骨损伤的修复和愈合。骨折发生后首先是在局部位置产生血肿,信号分子开始释放同时巨噬细胞活化,随后进入急性炎症期开始产生促炎细胞因子、生长因子和趋化因子,在它们的作用下招募骨髓间充质干细胞分化为骨祖细胞,随后进一步分化为成骨细胞和成纤维细胞等。如果急性炎症期炎症反应失调,则可导致骨形成抑制,将影响骨折的愈合。作为起关键成骨作用的成骨细胞,其自身也能作为调控者调控炎性反应。作为主要的促炎细胞因子IL-1β一旦发生过表达或者其表达失衡,将导致炎性反应期延长,延缓骨的愈合。NOD样受体蛋白3炎性体(NACHT,LRR-and pyrin-domain(PYD)-containing protein 3,NLRP3)是一种存在于细胞内相对分子质量为700000左右的多蛋白复合物,其激活后直接调控IL-1β的释放。而经由外周感觉神经所分泌的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)已经证实其除了对骨创伤的修复重建有促进作用以外,也可调控机体的炎症反应和IL-1β的表达。细胞线粒体内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可以通过上调细胞内Ca2+流动,导致Ca2+过载,使线粒体出现功能障碍,使NLRP3直接激活。综上所述,本项实验通过加入外源性CGRP干预小鼠成骨细胞,观察成骨细胞中NLRP3与IL-1β基因与蛋白表达情况,并检测细胞内ROS含量与线粒体的数量,探究CGRP是否通过NLRP3-ROS-IL-1β信号通路促进成骨细胞的增殖和分化,进一步阐明CGRP调控炎症反应来促进骨创伤修复的机制。方法:1.细胞培养和鉴定:取新生(出生24-48h内)BABL/c小鼠10只,在无菌环境下剪取颅骨,经二次酶消化法提取细胞,放置于浓度为5%CO2、温度为37℃培养箱中培养,镜下观察其生长至细胞密度80%时传代。传代至第三代细胞用碱性磷酸酶(ALP)染色与茜素红染色鉴定,同时保留第3代细胞用于后续实验中。2.实验分组:将其按5×105个/孔密度接种于两块六孔板的8个孔中,并采用完全随机设计分为4组(每组两个孔),培养24 h后再分别加入不同浓度的CGRP,各组加入CGRP剂量为:A组(对照组)0 ng/ml、B组10 ng/ml、C组30 ng/ml、D组100ng/ml。继续培养3d后进行下一步实验。3.成骨细胞NLRP3、IL-1β的表达检测:通过提取各组细胞的RNA与蛋白,进行RT-PCR、Western Blot和ELISA检测成骨细胞中NLRP3、IL-1β的表达情况。4.流式细胞仪检测ROS含量:取已加入CGRP处理3d后的各组细胞并同时新增一组处于同样状态但未加药的一组为空白对照组,经一系列处理后,流式细胞仪检测各组细胞内DCF(2’,7’-dichlorofluorescin,2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯)的荧光量从而得出ROS水平。5.激光共聚焦显微镜检测细胞内线粒体数量:取状态良好的第三代原代成骨细胞按1×105个/孔接种于4个激光共聚焦培养皿中,24h观察其贴壁后分组加入CGRP,行相应处理后加入Mito SOX Red reagent,用激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体数量。6.CGRP对成骨细胞增殖和分化的作用:6.1增殖:采用CCK-8法分别在0h、24h、48h、72h检测各组细胞的增殖情况。6.2分化:ALP与茜素红染色检测各组细胞的分化情况。结果:1.细胞培养和鉴定:经镜下观察细胞与成骨细胞特征相同,经ALP与茜素红染色鉴定结果示为阳性,确定所培养细胞为成骨细胞。2.成骨细胞NLRP3、IL-1β的表达检测:随着CGRP加入浓度的增加,NLRP3与IL-1β的m RNA与蛋白表达呈现下降的趋势。3.成骨细胞内ROS浓度与线粒体数量检测:随着CGRP加入浓度的增加,细胞内ROS浓度呈现下降的趋势,同时线粒体数量也表现为明显的减少。4.CGRP对成骨细胞的增殖和分化作用:CGRP对成骨细胞的增殖活性有明显的提高,同时分化能力也加强明显。结论:1.研究表明,CGRP能抑制NLRP3激活从而使IL-1β分泌减少,从而起到对炎症反应调节的作用;2.检测细胞内ROS含量与线粒体数量后,发现CGRP能促进细胞内线粒体自噬,从而减少ROS的产生量,抑制了NLRP3的激活;3.CGRP能增加成骨细胞的增殖活性,促进成骨细胞的增殖,同时对细胞的分化能力也有明显的增加。