AtGPRP3基因在拟南芥幼苗生长中的功能分析

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广泛分布于植物中的GPRP(Glycine and proline-rich protein)蛋白家族基因已被报道在植物的生长发育过程中具有重要的作用。然而,目前很少见对植物中GPRP蛋白基因功能进行深入研究的报道。本研究以已报道的、尚未见生物学功能研究的拟南芥AtGPRP3基因为研究对象,在分析该基因基本特点、蛋白进化关系和表达特性的基础上,进一步创建了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因材料,并对其在拟南芥幼苗生长发育过程中的作用进行了分析,初步发现AtGPRP3基因影响拟南芥幼苗的生长速率。为深入研究AtGPRP3基因的生物学功能奠定了基础。主要实验结果如下:1.拟南芥AtGPRP3基因的基本特点、蛋白进化关系和表达特征通过生物信息学分析发现,AtGPRP3基因包含2个外显子和1个内含子,共编码179个氨基酸,蛋白等电点(pI)为9.75,分子量(Mw)为17.8 kDa。蛋白进化分析结果表明,GPRP蛋白家族基因在单子叶和双子叶中不存在明显的分化。GUS染色和qRT-PCR结果显示,AtGPRP3基因主要在拟南芥的连座叶和茎上叶中的表达量较高,在成熟的果荚中表达较少。亚细胞定位结果表明,AtGPRP3蛋白主要在细胞核中表达。2.AtGPRP3的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料创建以pCXSN质粒构建了AtGPRP3的过量表达载体,利用Yao.ATU635s.HPT和pCAMBIA1300-Myc质粒分别构建了AtGPRP3的CRISPR敲除缺失表达突变体及其功能互补转基因遗传材料,目前已获得了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因纯合株系各3种类型,用于后续的功能分析实验等。3.AtGPRP3影响拟南芥幼苗的生长发育分别在pH5.8和pH8.0两种培养基上种植野生型拟南芥、AtGPRP3基因的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料,对各种材料幼苗地上部鲜重进行统计分析结果显示:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtGPRP3过量表达转基因植株幼苗地上部的鲜重显著减少,AtGPRP3缺失表达转基因植株幼苗的地上部鲜重显著增加,而功能互补转基因植株幼苗地上部鲜重与野生型的差异不显著。这些结果表明AtGPRP3对拟南芥幼苗地上部的鲜重可能具有负调控作用,进而影响拟南芥苗期的生长速率。4.AtGPRP3互作基因的筛选、鉴定与转基因功能验证在拟南芥幼苗cDNA酵母筛选文库构建和初筛的工作基础上,进一步开展了酵母双杂(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)实验鉴定等,共获得了3个AtGPRP3的互作基因AtCAT2、AtCLC3和AtCYSD1。进而利用CRISPR-Cas9技术,重点创建了互作基因AtCAT2的缺失表达拟南芥转基因突变体,并分别于pH5.8和pH8.0的两种培养基上种植生长,对其幼苗地上部鲜重进行统计分析结果表明:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtCAT2的CRISPR敲除缺失表达突变体幼苗地上部鲜重显著降低。这一结果与AtGPRP3过量表达转基因株系的表型类似;由此,我们初步推测:AtGPRP3与AtCAT2结合对AtCAT2本身的作用可能具有抑制的效果,但有待进一步实验证实。
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