毛囊是皮肤重要而复杂的附属结构,从内向外依次由毛干、内根鞘和外根鞘组成。隆突区是毛囊上段外根鞘向外隆起的部分,位于皮脂腺导管开口的下方,是立毛肌的附着处。在体实验显示隆突区细胞具有多向迁移能力,不仅能向下端毛球部迁移参与毛囊形成,而且能向上迁移参与表皮更新和皮脂腺维持。目前普遍认为毛囊上段隆突区存在原始干细胞群,称为毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs),毛囊隆突区干细胞在毛囊周期的维持以及组织的形成中发挥重要作用。尽管静息状态的毛囊干细胞呈慢周期性,但在外来信号刺激下,则表现出很强的增殖潜能力和克隆形成能力,是上皮各类干细胞中最具增殖潜力的干细胞库,并被认为是皮肤中表皮、毛囊和皮脂腺重要的细胞来源。但是直到现在对毛囊隆突区干细胞体外培养及其生物学性质仍了解甚少。本实验中采用改良消化法得到完整的毛囊,并根据隆突区形态特征,在体外显微切割分离毛囊隆突区,成功地进行细胞原代和传代培养,为深入研究毛囊干细胞生理功能及调节机制奠定了基础。β-连环蛋白(β-catenin)是一种胞内糖蛋白,具有双重功能。一是作为附着连接的组成部分,与钙粘蛋白结合形成复合体参与细胞间连接;二是作为信号分子,是Wnt信号途径的重要环节,在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。Wnt蛋白与相应受体结合将启动该信号途径,引起β-catenin在细胞内的堆积,β-catenin随之转入到细胞核中,通过与Lef1结合激活下游靶基因。最近研究发现β-catenin对于毛囊的发生发育是不可缺少的因素。在胚胎期,毛囊发育过程中如果β-catenin基因发生突变,毛囊的正常形成途径受阻;同时毛乳头可以促进毛囊干细胞定向分化,β-catenin作为重要调节因子参与毛囊干细胞分化途径的选择。为了更加清楚地了解β-catenin在毛囊干细胞增殖分化中的作用,本实验从以下几个方面开展研究:β-catenin及其相关粘附分子、信号分子在毛囊周期中的表达;毛囊干细胞体外分离培养及生物学性状观察;β-catenin在体外培养毛囊干细胞中的表达变化,其入核机制与Lef1的关系;β-catenin对毛囊干细胞增殖的影响以及cyclinD1、COX2的表达意义;β-catenin在毛乳头细胞定向诱导毛囊干细胞分化中的作用;最后将毛囊干细胞与毛乳头细胞混合移植到裸鼠皮内,观察毛囊再生情况及相关因子的表达。主要结果如下:1.在测定毛囊周期的基础上,采用免疫组化技术检测β-catenin及其相关粘附分子和信号分子在毛囊发育及正常周期中的表达,结果显示:(1)确定大鼠毛囊周期约为28d,其中1-18d为生长期,19-22d为退化期,23-28d为静止期。β-catenin在生长期毛囊中呈强表达,而在退化期和静止期表达微弱,提示β-catenin参与毛囊周期维持并发挥作用。(2)β-catenin的表达与毛囊发育的不同阶段具有相关性,主要出现在发育早期和成熟的毛囊中,提示β-catenin可能在启动毛囊发育中发挥作用;而DKK4阴性表达则反映此过程涉及到Wnt信号的激活。(3)细胞粘附分子E-cadherin和α-catenin同样在毛囊周期中呈周期性表达,与β-catenin表达相类似,说明E-cadherin和α-catenin参与毛囊周期维持,并可能通过β-catenin发挥作用。(4) Lef1促进生长期毛囊细胞的生长,作为β-catenin核内转录因子调节毛囊正常周期。2.完善了毛囊隆突区干细胞体外分离、培养的方法,观察毛囊干细胞的形态特征和生长状况,以及β-catenin在毛囊干细胞中的转位表达,并探讨了Lef1对β-catenin入核作用的调节机制,主要结果和结论如下:(1)用采用显微分离和酶消化两步法培养可得到活性较好的毛囊干细胞。(2)β-catenin在细胞内的表达随培养时间延长出现转位现象,同时细胞粘附分子E-cadherin的表达部位也发生改变,而α-catenin变化不明显。(3)扩增NL-Lef1和NS-Lef1质粒,转染后可见NL-Lef1促进细胞中β-catenin向核内转移,而NS-Lef1作用不明显,因此Lef1可能是β-catenin入核重要的调节因子。(4)结合细胞生长曲线和β-catenin转位表达,提示β-catenin入核可能与细胞增殖有关。3.采用转染、MTT、RT-PCR和Western blot等技术研究了β-catenin在毛囊干细胞增殖中的作用,并初步探讨其相关的信号机制,主要结果和结论如下:(1) LiCl提高细胞中内源性β-catenin表达水平,并表现出时间和剂量依赖性。(2) LiCl通过增强细胞内β-catenin表达,促进毛囊干细胞体外增殖,同时引起细胞粘附力下降,迁移力升高。(3)通过转染β-catenin可促进细胞外源性蛋白表达,转染早期可稳定干细胞并提高细胞克隆形成率,当β-catenin上升到一定水平,则明显促进细胞增殖。(4) RNAi通过沉默β-catenin基因,抑制细胞中的表达,β-catenin沉默细胞增殖能力明显下降。(5)β-catenin上调可促进Lef1与cyclinD1、COX2的表达;反之,RNAi抑制β-catenin表达将降低Lef1及下游靶基因的功能,说明β-catenin与Lef1结合形成复合物可通过激活cyclinD1、COX2来发挥促细胞增殖的作用。4.通过体内和体外两个途径研究了毛乳头细胞定向诱导毛囊干细胞分化,以及β-catenin信号途径在其中的作用,并对相关作用因子进行初步探讨,其主要结果和结论如下:(1)毛乳头细胞在体外可诱导毛囊干细胞定向分化,在体裸鼠移植可促进毛发再生,不仅说明毛乳头对毛囊干细胞定向分化的诱导作用,而且验证了体外培养毛囊干细胞的分化潜能。(2)β-catenin表达水平的提高可促进细胞定向分化为毛囊的能力,说明β-catenin信号分子在干细胞分化中同样具有重要作用。(3) DP细胞提高毛囊干细胞中β-catenin和c-myc的表达,提示DP可分泌细胞因子启动Wnt信号,进而通过β-catenin激活c-myc途径发挥作用。总之,本课题首先观察了β-catenin信号在毛囊组织中的表达规律,随后在建立毛囊干细胞体外分离培养的基础上,着重研究了β-catenin在毛囊干细胞增殖、定向诱导分化中的作用及相关机制,旨在为毛发的生长调节、皮肤组织工程和细胞治疗提供一定的理论基础。